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【感受態細胞的制備】 一步法制備感受態細胞

2013-5-15　　閱讀(1480)

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一、操作步驟：

1. 涂平板：為取得*的感受態效率，必須先把甘油菌或其它形式保存的菌種涂LB平板，并培養過夜。

2. 接種：取一有新鮮培養的菌種的LB平板，后續操作均在超凈臺內進行。把鑷子的頂端在70%酒精中蘸一下，并在酒精燈上略略燒一下，使鑷子的頂端處于無菌狀態。用鑷子夾取一個無菌的塑料槍頭或牙簽，從平板上挑取一個單克隆，然后把蘸有菌種的塑料槍頭或牙簽放到裝有3毫升LB的細菌培養試管內。上述操作也可以使用接種環等進行操作。

3. 培養：37℃約200rpm培養過夜，通常培養時間控制在16小時左右為宜。不宜超過18小時。

4. 再接種培養：根據需要制備的感受態細菌的量，按照1:100的比例用新鮮培養的過夜菌接種培養。例如取500微升的新鮮過夜菌到50毫升的LB中繼續37℃約200rpm培養。通常在大約培養2-2.5小時后OD600可以達到0.3-0.5。

5. 制備感受態細菌：在培養的細菌OD600達到0.3-0.5時，4℃2000g離心5分鐘收集細菌。如果離心沉淀前的菌量為50毫升，按后續操作進行，如果是其它體積則按比例換算后進行后續操作。用5毫升預冷的LB重新懸浮起細菌沉淀，加入5毫升在冰浴或冰水浴上融解的感受態制備試劑，混勻，冰浴放置5分鐘。然后再輕輕混勻，根據實驗需要適當分裝到1.5毫升或0.5毫升的離心管內后-70℃保存。

注：如果以后會只做單管的轉化，可以分裝成每管zui少50微升或100微升，如果以后一次性做多個轉化，可以每管分裝500微升或更大體積。-70℃保存后，感受態的效率會隨時間的推移逐漸下降，但通常在半年內使用轉化效率下降不會太多。總的來說，新鮮制備的感受態要比凍存的感受態轉化效率更高一些。

二、注意事項：

1. 需自行配制LB液體培養基和LB平板以用于細菌的培養和感受態效率的檢測。

2. 盡管凡是處于對數期內的細菌都可以用于感受態細菌的制備，但如果細菌生長的OD600的值達到0.3-0.5左右時，制備出來的感受態效果*。

3. 在制備感受態細菌的過程中均使用不含抗生素的LB。在使用感受態菌的過程中熱休克后的37℃培養時也必須使用無抗生素的LB，即便轉入的質粒是有抗性的。

4. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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