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流式檢測細胞樣品的制備

2013-4-24　　閱讀(1766)

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方案A：組織培養細胞的制備。
方案B：淋巴組織細胞制備。
方案C：非淋巴組織細胞制備。
方案D：全血PBMC的分離。

小貼士
1、流式細胞儀檢測需要將細胞制備成單細胞懸液。
2、避免細胞成團，以免堵塞流式細胞儀。
3、實體組織制備單細胞懸液需要物理方法分離或酶消化法進行，具體組織的方法，依照經驗來進行。


方案A: 組織培養細胞的制備

實驗材料：
Accutase™ 酶細胞分離培養基 （eBioscience Cat. No. 00-4555）
eBioscience® 流式染色緩沖液 （eBioscience Cat. No. 00-4222）
15ml或50ml的離心管。

實驗流程：
1、如果是懸浮細胞，則小心將細胞移入離心管中，進行計數和活力分析。進行步驟3.
2、如果是貼壁細胞，建議使用Accutase™ 酶細胞分離培養基 （eBioscience Cat. No. 00-4555）是細胞團塊分離，制備成單細胞懸液后置于離心管中計數和活力分析。（注意:accutase 可能會改變某些細胞表位，應該預實驗觀察避免其干擾檢測）
3、300g 離心5min。棄去上清，應用適量的流式染色緩沖液重懸細胞，調整細胞濃度為2×107/ml。


方案B：淋巴組織細胞制備。

實驗材料：
60×15mm 的組織培養皿
5ml 注射器
細胞過濾器（尼龍網過濾）
eBioscience® 流式染色緩沖液 （eBioscience Cat. No. 00-4222）
15ml或50ml的離心管。

實驗方案：
1、獲取組織（脾臟，淋巴結或胸腺）加入5~10ml eBioscience® 流式染色緩沖液 （eBioscience Cat. No. 00-4222），使用5ml注射器注射心研磨組織（或采用兩片載玻片研磨亦可）。
2、收集磨碎的細胞懸液，過濾至離心管中計數和活力分析。
3、300g 離心5min。棄去上清，應用適量的流式染色緩沖液重懸細胞，調整細胞濃度為2×107/ml。


方案C：非淋巴組織細胞制備。

剪刀和手術刀片
剪刀和手術刀片
PBS
60×15mm 的組織培養皿
5ml 注射器
細胞過濾器（尼龍網過濾）
eBioscience® 流式染色緩沖液 （eBioscience Cat. No. 00-4222）
15ml或50ml的離心管。

實驗流程:
1、獲取組織剪碎或切碎組織為2~4mm碎塊，用PBS稀釋適量的酶進行消化（溫度，方法依照酶的說明書）。
2、小心分離細胞團塊，過濾除去死細胞和碎片。
3、300g 離心5min，棄去上清。加PBS 5ml 300g 離心5min，棄去上清，重復一次。計數和活力分析。
4、300g 離心5min，棄去上清，應用適量的流式染色緩沖液重懸細胞，調整細胞濃度為2×107/ml。


方案D：全血PBMC的分離。

實驗材料：
PBS
Ficoll® 淋巴細胞分離液
eBioscience® 流式染色緩沖液 （eBioscience Cat. No. 00-4222）
15ml或50ml的離心管。

實驗流程：
1、以PBS 1:1稀釋血樣。將血樣輕輕加到2ml Ficoll® 淋巴細胞分離液或其他品牌亦可。
2、1000g離心20min,小心吸取分離液和PBS之間的霧狀細胞，即為PBMC。至新的離心管中。
3、4度，300g 離心5min,棄上清。應用適量的流式染色緩沖液重懸細胞，計數和細胞活力，調整細胞濃度為2×107/ml。

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