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ISSR分子標記的實驗原理及操作流程
點擊次數：1248 發布時間：2016-4-25
ISSR標記
ISSR（inter-simple sequence repeat）標記是一種類似RAPD，但利用包含重復序列并在3’或5’錨定的單寡聚核酸引物對基因組進行擴增的標記系統，即用SSR引物來擴增重復序列之間的區域。其原理具體是，ISSR標記根據生物廣泛存在SSR的特點，利用在生物基因組常出現的SSR本身設計引物，無需預先克隆和測序。用于擴增的引物一般為16-18個堿基序列，由1-4個堿基組成的串聯重復和幾個非重復的錨定堿基組成，從而保證了引物與基因組DNA中SSR的5’或3’末端結合，導致位于反向排列、間隔不太大的重復序列間的基因組節段進行PCR擴增。
一、實驗材料
不同來源的DNA(30-50ng/ul)。
二、實驗設備
PCR儀，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，電泳裝置，凝膠成像儀。
三、試劑
1、ISSR引物：購買成品或根據加拿大British Columbia大學設計的ISSR引物序列（見附錄）自己合成。
2、taq酶
3、10xPCR 緩沖液
4、MgCl2：25mmol/L。
5、dNTP：2.5mmol/L。
四、操作步驟：
1. 在25ul反應體系中，加入
模板DNA 1ul (30-50ng)
ISSR引物 1ul (約5pmol)
10xPCR Buffer 2.5ul
MgCl2 2ul
dNTP 2ul
Taq酶 1單位（U）
加ddH2O 至 25ul
混勻稍離心, 加一滴（約20 ul）礦物油。
2. 在PCR儀中預變性94℃ 2分鐘, 然后循環: 94℃ 1分鐘， 45℃-68℃ 40秒， 72℃ 1-2分鐘，共40輪循環。
3. 循環結束后, 72℃ 10分鐘，4℃保存。
4. 取PCR產物15ul加3ul上樣緩沖液(6x)于1.6% 或1.8% 瓊脂糖膠上電泳, 穩壓50-100Ｖ（電壓低帶型整齊， 分辨率高）。
5. 電泳結束，溴化乙錠染色20分鐘。
6. 用凝膠成像儀觀察、拍照。
操作流程簡圖：