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siRNA的設(shè)計(jì)與制備
點(diǎn)擊次數(shù)：1791 發(fā)布時(shí)間：2016-4-6
一．sirna的設(shè)計(jì)
在制備siRNA前都需要單獨(dú)設(shè)計(jì)siRNA序列。研究發(fā)現(xiàn)對哺乳動物細(xì)胞，zui有效的siRNAs是21-23個(gè)堿基大小，3’端有兩個(gè)突出堿基的雙鏈RNA；而對非哺乳動物細(xì)胞，比較有效的是長片段dsRNA。siRNA的序列專一性要求非常嚴(yán)謹(jǐn)，與靶mRNA之間一個(gè)堿基錯配都會顯著削弱基因沉默的效果。
選擇siRNA靶位點(diǎn)：
從轉(zhuǎn)錄本AUG起始密碼子開始，搜尋下游AA序列，記錄跟每個(gè)AA 3’端相鄰的19個(gè)核苷酸作為侯選的siRNA靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設(shè)計(jì)siRNA時(shí)不要針對5’端和3’端的非編碼區(qū)（untranslated regons, UTRs），原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。
序列同源分析：
將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。并非所有符合條件的siRNA都一樣有效，其原因還不清楚，可能始位置效應(yīng)的結(jié)果，因此對于一個(gè)目的基因，一般要選擇3-5個(gè)靶位點(diǎn)來設(shè)計(jì)siRNA。通常來說，每個(gè)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)3-4對siRNAs，選擇zui有效的進(jìn)行后續(xù)研究。
設(shè)計(jì)陰性對照：
一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA中的堿基序列打亂。當(dāng)然，同樣要保證它和其他基因沒有同源性。
此外網(wǎng)上提供提供免費(fèi)的siRNA設(shè)計(jì)工具www.qiagen。。ｃｏｍ/siRNA,
http://bioinfo.clontech.com/rnaidesigner/
二．siRNA的獲得
1．化學(xué)合成
盡管化學(xué)合成siRNA是zui貴的方法，但卻是zui方便的---研究人員幾乎不需要做什么工作就可以拿到高質(zhì)量的siRNA。如QIAGEN-Xeragon公司可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA（可帶標(biāo)記）。它zui適用的情況是：已經(jīng)找到zui有效的siRNA序列，需要大量siRNA進(jìn)行研究。QIAGEN還提供siRNA設(shè)計(jì)合成一體化服務(wù)“4-for Silencing siRNA duplexes” : 針對客戶給出的一個(gè)基因序列，由QIAGEN的專家設(shè)計(jì)并合成4對siRNA，HPP純度，保證至少一對抑制效率達(dá)到70%以上，如果達(dá)不到，免費(fèi)為客戶另行設(shè)計(jì)合成另外4對siRNA。
siRNA的設(shè)計(jì)與制備
Figure 1. HeLa-S3 cells were plated out in 24-well plates at a density of 6×104 cells in each well, 24 hours after transfection. Cells were transfected with lamin A/C siRNA using the transfection reagents indicated, according to the manufacturer’s protocol. mRNA was purified from the cells 48 hours after transfection and quantitative RT-PCR was performed using the QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit eith primers targeted to lamin.