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核酸分子雜交的概念、基本原理、探針及類型
點擊次數：1591 發布時間：2016-1-5
主要內容：一、分子雜交的概念
二、分子雜交基本原理
（一）DNA變性：
1、DNA變性的方法
2、增色效應
3、溶解曲線
4、融解溫度
5、影響Tm值的因素。
（二）復性：退火
一、分子雜交的概念：
分子雜交（molecular hybridization）指具有一定同源序列的兩條核酸單鏈（DNA或RNA），在一定條件下按堿基互補配對原則經過退火處理，形成異質雙鏈的過程。
利用這一原理，就可以使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針，去查找各種不同來源的基因組DNA分子中的同源基因或同源序列。
二、分子雜交基本原理：
（一）DNA變性 ：
DNA變性是指雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成單鏈無規則線團，因而發生性質改變（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等） 。
1、DNA變性的方法：
1)加熱；
2)改變DNA溶液的pH；
3)有機溶劑（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等理化因素。
2、增色效應：DNA在260nm處有zui大吸收值，這一特征是由于含有堿基的緣故。在DNA雙螺旋結構模型中堿基藏于內側，變性時由于雙螺旋解開，于是堿基外露，260nm紫外吸收值因而增加，這一現象稱為增色效應（hyperchromic effect） 。利用DNA變性后波長260nm處紫外吸收的變化可追蹤變性過程。
3、溶解曲線：如果升高溫度使DNA變性，以溫度對紫外吸收作圖，可得到一條曲線，稱為溶解曲線。
4、融解溫度：通常人們把50%DNA分子發生變性的溫度稱為變性溫度（即熔解曲線中點對應的溫度），由于這一現象和結晶的融解相類似，故又稱融點或融解溫度（melting temperature， Tm）。因此Tm是指消光值上升到zui大消光值一半時的溫度。
5、影響Tm值的因素：Tm不是一個固定的數值，它與很多因素有關：
1) 部因素：pH、離子強度。隨著溶劑內離子強度上升，Tm值也隨著增大。
2) 部因素：DNA的堿基比例、DNA的均一性 ；在相同條件下，DNA內G-C配對含量高，其Tm值也高。
6、DNA中的GC含量與Tm值關系：
Tm = 69。3+0。41 × % （G+C）
對于小于20bp的寡核苷酸，Tm=4（G+C）+2（A+T）
實驗表明DNA分子中（G+C）克分子含量百分比的大小與Tm值的高低呈直線關系。
（二）復性：變性DNA只要消除變性條件，二條互補鏈還可以重新結合，恢復原來的雙螺旋結構，這一過程稱為復性（renaturation） 。
退火：通常DNA熱變性后，將溫度緩慢冷卻，并維持在比Tm低25～30℃左右時，變性后的單鏈DNA即可恢復雙螺旋結構，因此，這一過程又叫做退火。
復性后的DNA，理化性質都能得到恢復。倘若DNA熱變后快速冷卻，則不能復性。
影響復性速度的因素：
1、DNA濃度：愈高，復性速度也愈快。
2、DNA片段的大小：DNA片段愈大，擴散速度愈低，使DNA片段線狀單鏈互相發現互補的機會減少。因此，在復性實驗中，有時將DNA切成小片段，再進行復性。
3、溫度：過高不利于復性。
4、溶液的離子強度：通常鹽濃度較高時，復性速度較快。
5、DNA順序的復雜性；簡單的分子復性很快，如polyd[T]和polyd[A]由于彼此互補識別很快，故能迅速復性。但順序較復雜的DNA分子復性則較慢。因此通過變性速率的研究，可以了解DNA順序的復雜性。