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轉座子標簽法克隆基因的改進
點擊次數：1316 發布時間：2015-12-31
1 轉座子及轉座子標簽法克隆基因
基因標簽法克隆植物組織中的基因是較為常用的一種方法，T-DNA和轉座子均可作為基因標簽。
轉座子zui早由美國的細胞遺傳學家Mc-clintock在玉米中發現，它是指基因組中一段特定DNA片段，能在轉位酶的作用下從基因組的一個位點轉移到另一個位點。轉座子不僅能在本基因組中轉座，也能轉入其它植物的基因組中。轉座的結果是使被轉入的基因失活，從而有效地誘導產生表型突變株。然后構建一個對應于突變株的基因庫，用作標簽的轉座子作為探針從基因庫中篩選相對應的克隆，分離得到相對應于變異的基因，這就是轉座子標簽克隆基因。
玉米的Ac/Ds轉座子家族是研究較為深入的植物轉座子。
2 Ac、Ds轉座子作基因標簽時遇到的問題
2．1 Ac屬于自主性轉座子，自己能編碼轉位酶，因此可直接用于基因標簽。但是由于Ac能自由地在基因組中轉座，結果使轉座產生的變異不穩定，給確定和分析突變基因帶來困難。
2．2 Ds屬非自主性轉座子，本身不能編碼轉位酶，必須依靠Ac轉座子產生的轉位酶才能產生轉座，因此Ds只有和Ac聯合使用才能做為基因標簽。
2．3 Ac和Ds聯合使用后遇到的問題是Ac本身的轉座成為除Ds之外又一個轉座因素，因此產生突變后，要首先經過遺傳分析確定突變因子是哪一個轉座子，才能用探針進行篩選克隆，這就增加了分離基因的難度和工作量。另外，Ac和Ds同時存在情況下，Ds能在Ac產生的轉座酶作用下頻繁轉位，難以產生穩定的突變，這又產生了與Ac單獨使用時存在的問題。
2．4 由以上分析，轉座子Ac和Ds聯合使用時必須從兩方面進行改進：首先，如何使Ac穩定下來，即只有產生轉位酶的能力而無轉座的能力，從而減少產生突變的轉座子種類。此外，如何使Ds轉座后，將產生轉座酶的Ac分離，從而使Ds穩定下來，不再轉座，使產生的變異得到穩定。人們對Ac、Ds進行改進后，發展了一種稱為sAc/Ds的雙系統法。
3 sAc/Ds雙系統法
3．1 對Ac的改進 Ac是一段長約為4.5kb的DNA片段，人為將其末端轉位必須的一段DNA序列切除后，它就不能再借助于轉位酶進行轉位，但仍能正常編碼轉位酶，這種修飾后的Ac稱為穩定的Ac(StableAc，sAc)。sAc產生的轉位酶量可由放在轉位酶基因之前的啟動子控制，從而控制Ds在基因組內的轉位頻率。如果用Ac本身的啟動子，其作用較弱，產生的轉位酶少，Ds轉座的頻率較低，轉變產生的突變就比較穩定。如果用強啟動子，則轉位酶活力高，Ds轉位頻繁，產生的變異頻率較高。同時為了篩選sAc的轉化株還需要在Ac上克隆一個標記基因。用于sAc/Ds雙系統法中sAc的構建方法略。
3．2 對Ds的改進 對Ds改進的目的有兩個：第1，能方便地檢測Ds是否已經從原位置轉座；第2，能檢測到Ds是否已轉移到基因組的另一個位置。改進的方法是首先將Ds克隆到一個標記基因的啟動子和密碼子之間，這樣可以通過篩選對抗生素的抗性來檢測Ds是否已經轉座。另外在不影響Ds轉座能力的前提下，在Ds的DNA序列中間克隆上另一個標記基因，這個基因將與Ds一起轉座，這樣就可以篩選對這一基因的抗性來檢測Ds是否已經轉座和轉座的位置。
3．3 sAc/Ds雙系統法克隆基因的原因及步驟
1)將sAc和Ds分別與T-DNA連接，在農桿菌的幫助下分別轉入植物中，獲得sAc的轉化植株和Ds的轉化植株。 2)將sAc轉化株與Ds轉化株雜交，挑選同時含有sAc和Ds的子一代植株。
3)雜合植株中，Ds在sAc產生的轉位酶幫助下轉座，引起某個基因突變，從而產生表型突變株。
4)通過突變植株的自交和回交，選擇僅含有Ds而無sAc的植株，從而使變異得到穩定。建立對應于變異株的基因文庫或cDNA文庫。
5)用IPCR的方法擴增與Ds相鄰的DNA片段，利用此片段作探針直接從基因文庫或cDNA文庫中篩選對應的基因克隆，通過DNA測序和比較了解該基因的特征。
6)穩定的變異株再與sAc轉化株雜交，使得Ds再次轉位，使突變的基因得到恢復，從而得到回復突變株，用于檢驗所得到的基因是否對應于變異的基因。
4 sAc/Ds雙系統法的應用
用sAc/Ds雙系統法克隆基因，容易得到回復突變株和容易產生再次突變克隆其它基因，與T-DNA做基因標簽相比省去了再次轉化的繁瑣程序，為克隆基因的工作帶來了極大方便。
理論上用sAc/Ds雙系統法克隆基因如果有足夠的轉化株，能克隆到任何一個基因，另外這種方法還可用于定點突變。如果對某一基因我們不知道它的表達產物，也不知道它何時在何部位表達，sAc/Ds雙系統法是一種較好的克隆基因的方法，該方法以其*的優點在克隆基因工作中將得到更廣泛的應用。