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引物（primers）設計
點擊次數：1584 發布時間：2015-12-14
引物（primers)
引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，
一個引物與感興趣區域一端的一條DNA模板鏈互補，
另一個引物與感興趣區域另一端的另一條DNA模板鏈互補。
引物的重要性
在整個PCR體系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結合，不與其他非目的DNA結合，PCR的靈敏性要求dna聚合酶能對引物進行有效的延伸，可見引物設計好壞與PCR結果密切相關。
引物設計原則
引物長度
一般為15-30個核苷酸，在做長片段PCR或做某些特殊的PCR時應使用較長的引物，但zui多不超過50個核苷酸。
堿基分布的均衡性
同一堿基連續出現不應超過5個
GC含量一般40-60%
GC含量太低導致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性
GC含量太高也易于引發非特異擴增。
引物Tm值
一般要求：55℃-65℃。
計算：
對于低于20個堿基的引物，Tm值可根據Tm=4(G+C)+2(A+T)來粗略估算
對于較長引物，Tm值則需要考慮熱動力學參數，從“zui近鄰位”的計算方式得到，這也是現有的引物設計軟件zui常用的計算方式。
Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15
引物二級結構
引物二聚體
盡可能避免兩個引物分子之間3’端有有較多堿基互補
發夾結構
尤其是要避免引物3’端形成發夾結構，否則將嚴重影響DNA聚合酶的延伸。
引物3’端
引物的延伸從3’端開始，因此3’端的幾個堿基與模板DNA均需嚴格配對，不能進行任何修飾，否則不能進行有效的延伸，甚至導致PCR擴增*失敗。考慮到密碼子的簡并性，引物3’端zui后一個堿基不與密碼子第三個堿基配對。