成人做爰免费视频免费看_成人a级高清视频在线观看,成人a大片在线观看,成人a大片高清在线观看,成人av在线播放,一a一级片,一级黄 中国色 片,一级黄 色蝶 片,一级黄色 片生活片

二、材料和方法

1、材料 氯金酸（HAuCl·Cl3·4H2O）：成都化學試劑廠產品：葡萄球菌A蛋白（SPA）：衛生部上海生物制品研究所;細胞毒素相關蛋白A（CagA）：基因工程產品，本所制備;酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測抗CagA-IgG試劑盒：上海晶瑩生物制品公司;血清標本：由第四軍醫大學中心血庫及消化內科提供;Z 323 K低溫高速離心機：德國;LGJ 0.5-Ⅱ冷凍干燥機：軍事醫學科學院實驗儀器廠;點膜器：美國Bio-Dot公司。

2、 方法

（1）15 nm膠體金的制備 參照文獻[4]進行。 其步驟為：去離子水溶解氯金酸使其終濃度為0.2 g/ L，煮沸后每100 mL加入10 g/ L檸檬酸三鈉水溶液4 mL，繼續煮沸7min. 電鏡觀察膠體金的粒度。

（2） 免疫膠體金的制備 取顆粒直徑為15 nm的膠體金100 mL，用0.1 mol/ L K2CO3調至pH 6.2，在攪拌狀態下加入SPA（1 g/ L） 0.6 mL，繼續攪拌10min;加入50 g/ L BSA 10 mL，繼續攪拌5min. 4℃下3000 r/ min離心5min，棄沉淀，上清液以12 000 r/ min離心15min，小心移去上清液，沉淀即為制備的膠體金。 用20 mL懸浮液懸浮沉淀，以吸水纖維吸附后冷凍干燥4 h，4℃保存備用。

（3）免疫層析測試條的制備 測試條由吸水纖維、硝酸纖維素膜和吸水濾紙三部分組成。 吸水纖維部分附著有膠體金免疫復合物;在硝酸纖維素膜上用CagA（1.5 mg/ L）及人IgG（1 mg/ L）劃線（1 mm寬），分別作為檢測線和對照線，晾干，用50 g/ L BSA封閉2 h，以0.01 mol/ L PBS洗滌3次，干燥后依次粘于白色塑料片（支持物）上，切成0.5 cm×10 cm的試條，加干燥劑密封保存。

（4）抗Hp-CagA IgG的檢測 以新鮮血清為佳。 試管中加入0.1 mL～0.2 mL血清，將測試條含有金標記物的一端插入血清內即可。 結果判定：以測試條硝酸纖維素膜上出現兩條紅色條帶為抗Hp-CagA IgG陽性;僅出現一條紅色條帶（靠近吸水濾紙端，對照線）為陰性。 如果無紅色條帶出現則視為試劑失效。 結果確定時間：強陽性標本在5min內即可在檢測線處見到紅色膠體金顆粒聚集;弱陽性標本約需要10min確定結果。

三、結果

1、膠體金顆粒直徑的電鏡觀察 用預先處理好的覆蓋有Formvar膜的鎳網侵入膠體金溶液中，取出放入空氣中干燥，然后在透射電鏡下觀察，可見膠體金顆粒大小均勻一致，顆粒直徑約為15 nm（圖1）。

圖1 膠體金顆粒的透射電鏡觀察結果。

2、試劑盒的特異性及敏感度 采用本實驗所建立的膠體金免疫層析法與ELISA試劑盒對比檢測西京醫院門診及住院326例患者血清中的抗Hp-CagA IgG，結果見表1.

表1 GICA與ELISA檢測結果比較

ELISA 合計

+ -

GICA + 178 　6 184

- 　5 137 142

合計 　 183 143 326

由表1可見，若以ELISA檢測抗Hp-CagA抗體試劑盒作為參照標準，則GICA法的特異性為95.8%，敏感度為97.3%，總符合率為96.6%。

3、穩定性試驗 GICA試劑盒于4℃下放置6 mo，每月檢測抗Hp-CagA IgG陽性及陰性血清各50份，該試劑盒的各種性能指標均穩定。 將GICA試條于37℃溫箱放置6 d，做熱穩定性試驗，與放置4℃的試條對照，結果無明顯差別。

三、討論

免疫層析是出現于20世紀80年代初期的一種*的免疫分析方式。 Beggs et al[1]于1990年報道了斑點免疫層析試驗（dot immunochromatographic assay, DICA），用以檢測孕婦尿液中的HCG進行早孕診斷，繼而有采用該方法檢測乙型肝炎病毒表面抗原[2]及抗HCV-IgG[3]的報道。 本文建立的膠體金免疫層析快速檢測抗Hp-CagA抗體的方法集中了免疫與層析色譜的特點，使待測樣品中的IgG與吸水纖維上的金標SPA不斷結合，形成IgG-金標SPA復合物，再由層析作用，持續通過硝酸纖維素膜，與膜上固相CagA結合。 該方法具有以下特點：①敏感度高：由于在試驗中所有樣品均經過狹窄的硝酸纖維素膜，實際上是對被測的物質起到了濃縮的作用，從而使免疫層析比免疫滲濾法更為敏感，與ELISA檢測的敏感度相近。 ②特異性強：本試劑盒采用高活性的重組CagA純品作抗原，極大地提高了檢測的特異性。 膠體金及免疫膠體金的性能，也是影響特異性的一個重要因素。 研究中我們結合有關文獻[4-6]，經過不斷的試驗，制備了適合本方法開展的直徑為15 nm的膠體金顆粒，并zui大限度地提高標記的效率。 ③穩定性及重復性好：免疫膠體金的穩定性是影響試劑盒質量的一個重要因素。 免疫膠體金的制備，是金顆粒表面吸附蛋白質以形成牢固結合的過程。 該過程受酸堿度、離子強度、免疫膠體金的濃度、溫度等因素的影響，其中主要取決于pH值。 為此，我們優化了膠體金標記的*條件和免疫膠體金懸浮的*配方，使該試劑保存時間延長。 ④操作簡便：本試劑盒的核心部分僅為一個試條，構造十分簡單;結果顯示為紅色的條帶，判斷非常容易;操作更是方便，不需任何設備，特別適應于中小型醫院， 醫師診所和急診檢驗，并可在家中測試。 ⑤快速：GICA操作過程一般僅需幾分鐘，zui長不超過10min;而在ELISA操作中，由于涉及加血清、標記物、底物及繁復的洗板等步驟，約需2 h方可完成。

研究表明，CagA陽性Hp感染與上消化道疾病的關系更為密切[7-9]。 來自亞太地區的研究提示，Hp感染者中CagA陽性Hp感染率相當高[10-12]。 為適應大面積的CagA陽性Hp的篩選，本文所建立的檢測血清中抗CagA IgG的方法無疑對于CagA陽性Hp感染的快速診斷有重要意義。 由于GICA檢測血清標本中抗CagA IgG具有特異性強、靈敏度高、穩定性好、簡易快速、無須儀器設備等優點，因而有廣泛應用前景。

通訊作者 韓鋒產，710033，陜西省西安市長樂西路17號，第四軍醫大學全軍基因診斷技術研究所。

作者簡介：韓鋒產，男，1963-05-08生，陜西省咸陽市人，漢族。 1985年延安大學醫學系畢業，1990年西安醫科大學生物化學碩士，1995年第四軍醫大學生物化學博士，主要從事基因診斷方面的研究工作，發表論文12篇。

Correspondence to:HAN Feng-Chan, Chinese PLA Institute of Gene Diagnosis, Fourth Military Medical University, 17 Changle Xilu, Xi'an 710033, Shaanxi Province, China

. +86·29·3374771

.Hanfc@263.net

四、參考文獻

1 Beggs M, Novotny M, Sampedro S. A selfperforming chromatographic immunoassay for the qualitative determination of human chorionic gonadotrophin（HCG） in urine and serum. Clin Chem, 1990;36:1084-1085

2 Pi GH, He HY, Gu SY, Zhang SX, Deng Y. Detection of serum anti-HCV IgG by gold conjugated immunosorbent assay. Zhonghua Shiyan He Linchuang Bingduxue Zazhi, 1995;9:371-373

3 Zhou JH, Rong GY, Yang SC, Zhang JZ, Cheng Y, Ren JM. Gold immunochromatography assay for the detection of HBsAg. Zhonghua Yixue Jianyan Zazhi, 1998;21:30-32

4 Roe CD, Courtoy PJ, Baudhuin P. A model of protein-colloidal gold iteraction. J Histochem Cytochem, 1987;35:1191-1198

5 Wang BL, Scopsi L, Martvig M, Larsson LI. Simplified purification and testing of colloidal gold probes. Histochemistry, 1985;83:109-115

6 Seno S, Akita M, Hsueh CL. A new method of the immunocytochemical detection of cellular antigens for light and electron microscopy. Histochemistry, 1989;91:449-454

7 Covacci A, Censini S, Bugnoli M, Ptracca R, Burroni D, Macchia G. Molecular characterization of the 128kDa immunodominant antigen of Helicobacter pylori associated with cytotoxicity and duodenal ulcer. Proc Natl Acad Sci USA, 1993;90:5791-5795

8 Ching CK, Wong BCY, Kwok E, Ong L, Ccvacci A, Lam SK. Prevalence of CagA-bearing Helicobacter pylori strains detected by the anti-CagA assay in patients with peptic ulcer disease and in controls. Am J Gastroenterol, 1996;91:949-953

9 Crabtree JE, Wyatt JI, Sobala GM, Miller G, Tompkins DS, Primrose. Sestemic and mucosal human responses to Helicobacter pylori in gastric cancer. Gut, 1993;34:1339

10 Maeda S, Ogura K, Yoshida H, Funai F, Ikenoue T, Takahashi M. Major virulence facters, VacA and CagA, are commonly positive in Helicobacter pylori isolates in Japan. Gut, 1998;42:338-343

11 Miehlke S, Kisler K, Kim JG, Figura N, Small SM, Graham DY. Allelic variation in the cagA gene of Helicobacter pylori obtained from Korea compared to the United States. Am J gastroenterol, 1996;91:1322-1325

12 Pan ZJ, Van der Hulst RWM, Feller M, Xiao SD, Tytgat, Dankert J. Equally high prevalence of infection with cagA-positive Helicobacter pylori in Chinese patients with peptic ulcer disease and those with chronic gastritis-associated dyspepsia. J Clin microbiol, 1997;35:1344-1347