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如何用elisa方法進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)染色
點(diǎn)擊次數(shù)：2294 發(fā)布時(shí)間：2013-7-23
一、材料和試劑
1、玻片：須用免疫組化玻片，或用2%多聚賴氨酸包被處理玻片。
2、5-10%正常山羊血清封閉液，用PBS配。
3、3%牛血清白蛋白（BSA），用PBS配。
4、0.01M pH7.4 PBS
5、1% BSA-PBS（含0.05% Tween20）
6、AEC底物
（1）底物緩沖液（20X） PH 4.6
醋酸（分子量60.6） 30.6ml
Triton X-100
醋酸鈉 3H2O（分子量136.1）66.68克
加蒸餾水到960ml，調(diào)pH到4.6，zui后加蒸餾水到總體積1000ml。
（2）AEC（20X）
AEC 15mg/ml，溶在DMF（二甲基甲酰胺，分子式HCOH（CH3）2 分子量73.10中）
（3）0.6% H2O2（20X）
臨用時(shí)，（1）（2）（3）各50ul，在1ml雙蒸餾水中混勻30分鐘內(nèi)有效。
7、DAB（即DAB-4HCL）
（1）1.5克DAB在100ml水溶液中（20X）
（2）1M Tris（20X），用HCl調(diào)PH到7.4
（1）（2）（3）各滴加入1ml二蒸水中，新鮮配，避光，30分鐘內(nèi)有效。溶解后（可加熱到50℃），加水合氯醛50克（水合氯醛Chloral Hyclrate，分子量165.4），枸櫞酸1克，充分溶解，于棕色瓶中，室溫或400C保存。
8、蘇木素復(fù)染液
蘇木素 1克
碘酸鈉 0.2克
鉀礬 50克
水 1000ml
9、含10%及2%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液。
10、3% H2O2：30%H2O21份，加9份雙蒸水，臨用時(shí)配。
11、細(xì)胞抗原玻片及96孔細(xì)胞抗原板
12、封片液：1克明膠，溶于30ml 35℃水中，加入35ml甘油（或用甘油封片）和650mg石碳酸（先溶于0.6ml水中）。
二、細(xì)胞內(nèi)源過氧化物酶阻斷（使用HRP標(biāo)記二抗或SP法時(shí)必須阻斷）
1、從冰箱取出細(xì)胞片或細(xì)胞板，置室溫或37℃ 10-15分鐘，使恢復(fù)溫度。
2、加3% H2O2，細(xì)胞片20ul/孔，培養(yǎng)板100ul/孔，使充分覆蓋住細(xì)胞。
3、室溫10分鐘后，甩掉 H2O2，用PBS輕輕淋洗2分鐘。用濾紙吸干細(xì)胞周圍水份，96孔在濾水紙上扣干，但注意保持細(xì)胞濕潤(rùn)。
三、封閉
細(xì)胞片用5-10%正常山羊血清（20ml/孔），細(xì)胞板用2-5%BSA（PBS配制）100ul/孔，置37℃孵育30分鐘后甩掉封閉液，不洗。
四、免疫化學(xué)染色
1、分別加一抗和所有對(duì)照一抗，細(xì)胞法10-20ul/孔，細(xì)胞板50ul/孔，使充分覆蓋細(xì)胞。37℃1小時(shí)或4℃冰箱過;
2、棄去一抗，如為細(xì)胞涂片用PBST輕輕簡(jiǎn)單淋洗1次后，浸于100 mL含PBST洗杯，漂洗（在慢速搖床上）3-5分鐘，轉(zhuǎn)入第二杯PBS（100 ml），如上法漂洗3-5分鐘。擦干細(xì)胞片周圍水分，96孔板則倒掉一抗后，每孔加滿PBST在搖床上搖洗3-5分鐘后倒掉，在濾紙上扣干，但保持細(xì)胞濕潤(rùn)，反復(fù)3-4次;
3、加SP試劑（SP法，即放大法）
（1）加已優(yōu)選好的濃度的Biotin標(biāo)記二抗，細(xì)胞片10ul/孔，細(xì)胞板50ul/孔，使充分復(fù)蓋細(xì)胞。37℃孵育30分鐘;
（2）按免疫化學(xué)染色“2”所述方法洗滌和擦干;
（3）加已優(yōu)選好濃度的SP試劑，用量同“（1）”，37℃孵育30分鐘后按免疫化學(xué)染色“2”法洗滌及擦干;
4、間接法加二抗（不放大法）
方法同SP法，但不用Biotin標(biāo)記二抗，而改用HRP直接標(biāo)記二抗。并省略（3）步驟;
5、加底物顯色
（1）加足量的AEC顯色液，充分覆蓋細(xì)胞層，細(xì)胞玻片20ul/孔，細(xì)胞培養(yǎng)板50ul/孔，置于37℃恒溫箱孵育5-10分鐘，一般在顯微鏡下根據(jù)結(jié)果顏色的呈現(xiàn)情況掌握染色時(shí)間，以得到滿意的結(jié)果（陽性對(duì)照顯色程度為“+++” ），用自來水即可終止反應(yīng);
（2）復(fù)染：蘇木素染液（使用時(shí)間不超過兩個(gè)月）加蘇木素復(fù)染液1-2滴，1分鐘左右，在自來水下輕輕沖洗掉蘇木素，再浸于PBS中約30秒鐘返藍(lán)，zui后在蒸餾水中漂洗。
6、封片
洗后細(xì)胞片擦去周圍水分，滴加1滴甘油—明膠封片液，加蓋玻片，除去氣泡，用指甲油或樹膠封固玻片。
五、結(jié)果判斷
陽性——誘導(dǎo)細(xì)胞有10%-30%顯紅色，強(qiáng)度不一，未誘導(dǎo)陽性細(xì)胞（1-30%）;陰性——誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)BCBL-1細(xì)胞*不顯色（排除邊緣效應(yīng)）
六、注意事項(xiàng)
1、一抗、二抗的稀釋采用1% BSA/PBS，Sterptavidin-HRP的稀釋采用PBS;
2、整個(gè)反應(yīng)過程在濕盒中進(jìn)行（細(xì)胞片）;
3、洗滌時(shí)應(yīng)使用染色缸（細(xì)胞片）;
4、對(duì)照系統(tǒng)，必須要做的對(duì)照系統(tǒng)：陽性對(duì)照：標(biāo)準(zhǔn)一抗，陽性血清，陽性上清;陰性對(duì)照：（1）陰性一抗對(duì)照：小鼠免疫前血清、測(cè)上清時(shí)用原克隆上清液;（2）陰性抗原細(xì)胞對(duì)照：未感染病毒的細(xì)胞，每個(gè)待測(cè)及對(duì)照均須做陰性細(xì)胞對(duì)照：空白對(duì)照：不加一抗，用1%BSA替代;無關(guān)對(duì)照：與本項(xiàng)目無的*抗體。