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有高特異性和高精度的胞嘧啶堿基編輯器
點擊次數：1121 發布時間：2020-8-28
在一項新的研究中，高彩霞教授課題組基于截短的人APOBEC3胞嘧啶脫氨酶（A3Bctd）構建出兩種新的CBE，并開發出一種高通量檢測方法，用于評估植物CBE中不依賴于單向導RNA（sgRNA）的脫氨變化。
他們首先開發了一種快速、高通量且廉價的方法---nSaCas9介導的正交R環測定法---來評估植物中的CBE。在這種測定法中，正交CRISPR系統nSaCas9被用于在植物細胞中產生單鏈DNA（ssDNA）區域，作為不依賴于sgRNA的脫氨變化的靶標。為了評估nSaCas9介導的正交R環測定，他們將它與全基因組測序（WGS）測定進行了比較。
一致性的結果表明，nSaCas9介導的正交R-loop測定法為評估CBE的不依賴于sgRNA的脫靶活性提供了一種合理、快速和高通量的方法。
他們隨后通過合理設計構建出16個A3Bctd脫氨酶變體，并評估了它們的在靶效率（on-target efficiency）和不依賴于sgRNA的脫靶活性。他們利用nSaCas9介導的正交R環測定法對這些A3Bctd-BE3變體進行了測試，并選擇了7個與高效的在靶編輯活性和下降的脫靶活性相關的突變。之后，他們將這些突變進行組合，產生了9個新的具有雙氨基酸或三氨基酸替換的A3Bctd-BE3變體。
通過這種方式，他們得到了兩個新的CBE變體：A3Bctd-VHM-BE3和A3Bctd-KKR-BE3，這兩個變體表現出高效的在靶活性和明顯下降的不依賴于sgRNA的脫靶活性。
此外，這兩種新的CBE變體在它們的靶位點上的編輯表現得更，主要產生單個和兩個胞嘧啶（C）編輯。他們還通過全基因組測序驗證了A3Bctd-VHM-BE3和A3Bctd-KKR-BE3的高特異性