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撫生試劑-免疫酶細胞化學酶標抗體法
閱讀：215 發布時間：2014-5-30免疫酶細胞化學酶標抗體法
酶標抗體的染色可分為直接法和間接法。直接法是將酶直接標記在每一種抗體上，間接法是將酶標記在第2抗體上，檢測組織細胞內的特定抗原物質。間接法所用的第l抗體是對組織細胞內某種抗原的特異性抗體(80％～90％的抗血清系由家兔制得，而絕大多數單克隆抗體系由小鼠制備)；第2抗體則為第1抗體[家兔和(或)小鼠的IgG]的抗體。所以，只要不同的第1抗體均來自同一種屬，同一標記的第2抗體就能用來顯示不同特異性抗原的存在，這樣可避免直接法中標記每一種第1抗體的麻煩，并且提高了敏感度。目前的ICC染色中，以間接法應用zui廣，在此著重介紹間接法的染色程序。
(1)切片準備：①石蠟切片經二甲苯脫蠟，再經不同濃度的乙醇溶液處理。②固定與未固定的新鮮組織冷凍切片，室溫干燥2h以上。
(2)未固定的新鮮組織切片，經丙酮固定20—30min后，用蛋白酶處理，去除固定劑交聯造成的空間遮蔽，在室溫下風干(15—30min)；已固定的組織冷凍切片及石蠟切片，根據需要可進行組織抗原的激活。
(3)用蠟筆沿切片周圍勾劃一道屏障，以避免孵育液流失及孵育過程中切片干燥，同時也能節省抗體用量，保持切片與抗體的充分接觸，風干。
(4)切片經PBS或其他緩沖液漂洗3次，每次2min，溶解除去冷凍切片上的包埋劑。但應用ALP標記抗體時，禁用二甲胂酸鈉緩沖液漂洗，因后者可使ALP失活。
(5)根據需要，用甲醇十0．3％H2O2處理切片15—30min(室溫)，封閉內源性過氧化酶的活性。應用ALP標記抗體時此步驟可省略。
(6)PBg漂洗2次，每次2min，移至0，05％Tween-20／PBS(或0．22％一1％TritonX-lOO)中5min(室溫)。Tween-20為一種表面活性劑，除具有清潔作用外，還可增加組織的通透性，有利于組織細胞內抗原的
顯示。
(7)0．1％一1％BSA濕盒內孵育15～25min(室溫)后，輕輕棄去孵育液(不沖洗)；以阻斷組織與抗體的非特異性結合，降低背景染色。
(8)滴加含0．2％BSA／0．05％NaN3／PBS稀釋的第1抗體(抗體用量：每張切片一般為50～80P1)，濕盒內孵育1～2h(20—25℃)。
(9)PBS充分沖洗(3次X 2rain)，以去除切片上非特異吸附的抗體。應用不同的第1抗體或同時進行對照標本染色時，需分別沖洗，以防相互污染。
(10)滴加含0．2％BSA／PBS稀釋的HRP酶標記的第2抗體，20～25℃濕盒內孵育45—60min。
(11)PBS漂洗(3次X2min)。
(12)未固定或固定較弱的冷凍切片，此處可輕微固定。首先將切片從PBS移至Tris—HCl緩沖液(TBS)中，去除PBS，以防其中的磷酸與后面使用的固定液中的CaCl2形成磷酸鈣而沉淀，然后用固定液固定5min
(室溫)此時輕微固定，既不影響抗原抗體結合，又較有利于保存第1抗體孵育前的組織抗原，尤其適用于單克隆抗體的ICC染色。
(13)呈色：HRP標記抗體的呈色液為0．01％一0．1％H202，0．01％一0．05％DAB和0．05—0．1mol／LWris—HCI(pH7．4)。切片經PBS或Tris—HCl液漂洗后，置上述呈色液內10～15min(室溫，暗處)，亦可在光學顯微鏡下控制顯色速度，終產物為棕褐色沉淀。
(14)將切片置流水中，終止呈色反應。
(15)DAB呈色的標本可用系列乙醇脫水、Hemo-De透明、DPX封固。其他物質呈色的標本在有機溶劑中沉淀物易溶解、褪色，用水溶性封固劑(如明膠甘油等)封固可使切片保存時間更長。
(16)顯微鏡檢查，觀察記錄結果。