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撫生試劑-膠體金標(biāo)記蛋白的制備
閱讀：198 發(fā)布時間：2014-5-16膠體金標(biāo)記蛋白的制備
膠體金對蛋白的吸附主要取決于pH值，在接近蛋白質(zhì)的等電點或偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結(jié)合物。如果膠體金的pH值低于蛋白質(zhì)的等電點時，則會聚集而失去結(jié)合能力。除此以外膠體金顆粒的大小、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)的分子量等都影響膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合。
1．待標(biāo)記蛋白溶液的制備 將待標(biāo)記蛋白預(yù)先對0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析，以除去多余的鹽離子，然后100 000g4℃離心1h，去除聚合物。
2．待標(biāo)膠體金溶液的準(zhǔn)備 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl調(diào)膠體金液的pH值。標(biāo)記IgG時，調(diào)至9.0；標(biāo)記McAb時,調(diào)至8.2；標(biāo)記親和層析抗體時，調(diào)至7.6；標(biāo)記SPA時，調(diào)至5.9～6.2；標(biāo)記ConA時，調(diào)至8.0；標(biāo)記親和素時，調(diào)至9～10。由于膠體金溶液可能損壞pH計的電板，因此，在調(diào)節(jié)pH時，采用精密pH試紙測定為宜。
3．膠體金與標(biāo)記蛋白用量之比的確定
（1）根據(jù)待標(biāo)記蛋白的要求，將膠體金調(diào)好pH之后，分裝10管，每管1ml。
（2）將標(biāo)記蛋白（以IgG為例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5µg/ml～50µg/ml，分別取1ml，加入上列金膠溶液中，混勻。對照管只加1ml稀釋液。
（3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10％NaCl溶液，混勻后靜置2h，觀察結(jié)果。
（4）結(jié)果觀察，對照管（未加蛋白質(zhì)）和加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象；而加入蛋白量達(dá)到或超過zui低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。以穩(wěn)定1ml膠體金溶液紅色不變的zui低蛋白質(zhì)用量，即為該標(biāo)記蛋白質(zhì)的zui低用量，在實際工作中，可適當(dāng)增加10％～20％。
4．膠體金與蛋白質(zhì)（IgG）的結(jié)合 將膠體金和IgG溶液分別以0.1Mol/L K2CO3調(diào)pH至9.0，電磁攪拌IgG溶液，加入膠體金溶液，繼續(xù)攪拌10min，加入一定量的穩(wěn)定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發(fā)生沉淀。常用穩(wěn)定劑是5％胎牛血清（BSA）和1％聚乙二醇（分子量20KD）。加入的量：5％BSA使溶液終濃度為1％；1％聚乙二醇加至總?cè)芤旱?／10。