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技術(shù)文章

RT-PCR反轉(zhuǎn)錄酶與合成 cDNA 引物的選擇

閱讀:227          發(fā)布時(shí)間:2024-12-9

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcription-Polymerase Chain ReactionRT-PCR) 的原理是:提取組織或細(xì)胞中的總 RNA,以其中的 mRNA 作為模板,采用 OligodT) 或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。再以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,而獲得目的 基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RT-PCR 使 RNA 檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí),使一些極為微量 RNA 樣品分析成為可能。

一、反轉(zhuǎn)錄酶的選擇

1Money 鼠白血病病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶:有強(qiáng)的聚合酶活性,RNA H 活性相對(duì) 較弱。最適作用溫度為 37℃。

2.禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶:有強(qiáng)的聚合酶活性和 RNA H 活性。最適作用 溫度為 42℃。

3Thermus thermophilusThermus flavus 等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶:在 Mn2+存在下,允許高溫反轉(zhuǎn)錄 RNA,以消除 RNA 模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

4MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶的 RNase H-突變體:商品名為 Superscript SuperScriptⅡ。此種 酶較其它酶能多將更大部分的 RNA 轉(zhuǎn)換成 cDNA,這一特性允許從含二級(jí)結(jié)構(gòu)的、低溫反 轉(zhuǎn)錄很困難的 mRNA 模板合成較長(zhǎng) cDNA

二、合成 cDNA 引物的選擇

1. 隨機(jī)六聚體引物:當(dāng)特定 mRNA 由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難于拷貝其全長(zhǎng)序列時(shí),可采用隨機(jī)六聚體引物這一不特異的引物來(lái)拷貝全長(zhǎng) mRNA。用此種方法時(shí),體 系中所有 RNA 分子全部充當(dāng)了 cDNA 第一鏈模板,PCR 引物在擴(kuò)增過(guò)程中賦予所需要的 特異性。通常用此引物合成的 cDNA 96%來(lái)源于 rRNA

2Oligo(dT):是一種對(duì) mRNA 特異的方法。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞 mRNA 具有 3’端 Poly(A+)尾,此引物與其配對(duì),僅 mRNA 可被轉(zhuǎn)錄。由于 Poly(A+)RNA 僅占總 RNA 1-4%,故此種引物合成的 cDNA 比隨機(jī)六聚體作為引物和得到的 cDNA 在數(shù)量和復(fù)雜性 方面均要小。

3. 特異性引物:最特異的引發(fā)方法是用含目標(biāo) RNA 的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物, 若 PCR 反應(yīng)用二種特異性引物,第一條鏈的合成可由與 mRNA 3’端最靠近的配對(duì)引物起 始。用此類(lèi)引物僅產(chǎn)生所需要的 cDNA,導(dǎo)致更為特異的 PCR 擴(kuò)增。

 


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