聯系電話
上海寶葉生物科技有限公司
中級會員·6年
從噬菌體抗體文庫中分離抗原特異性抗體，是通過讓噬菌體進入到在抗原上進行的重復性選擇循環來實現的。理想情況下，僅需l輪選擇即可完成。但事實是，絲狀噬菌體常常非特異性地結合到支持物表面，從而限制了每輪所能獲得的富集水平。實際上，需要2～5輪的選擇。現在已設計了許多各自不同的選擇方法；其中包括在固相支持物上包被抗原進行生物淘選，使用免疫親和層析注或BIAcore傳感芯片，用生物素化抗原選擇E37J，多肽E383，在固定的原核生物E393或哺乳動物E403細胞、組織培養細胞E41-433、新鮮細胞上進行選擇，采用分揀流程如FACS和MACS進行減數選擇，在組織切片或組織斷面上富集、內化選擇E493以及原則上可在活體動物中選擇，如在多肽噬菌體文庫方面所報道的做法。更復雜的選擇方法還包括“路徑發現者/代理分子”Pathfinder/Proximol和一些建立在通過抗體抗原相互作用恢復噬菌體感染性機制之上的選擇方法。總體上?選擇方法可分為兩大類：一類是用已知抗原嘗試分離抗體；另一類是用噬菌體抗體作為研究工具來尋找未知的靶抗原（例如針對細胞表面的抗原）。
如果可以得到純化抗原，選擇將zui為有效。。雖然選擇僅需少量抗原，但篩選所需要的抗原量就大了許多。總體上，500ug～lmg的抗原對于一系列選擇和篩選是綽綽有余的。如果采用低濃度抗原并能儲存及重復使用，那么，完成整個過程所用抗原量可少至100ug。通過采用封閉劑．如脫脂奶粉、明膠、酪蛋白、BSA或Tween20，可以抑制非特異性的噬菌體結合。
由于天然文庫中每種噬菌體抗體的拷貝數很少，因此*輪選擇條件要盡量采用非嚴謹條件。總體上，此階段增加嚴謹性會適得其反，因為這會減少洗脫下來的噬菌體數目，同時并未增加陽性噬菌體的比例。*輪選擇后，每種單個噬菌體抗體數目大幅提高，而隨后洗滌的嚴謹性也可以加大許多。
zui常用的選擇方法涉及用抗原包被的塑料免疫管（Nunc）。這種試管結合力可以達到每平方厘米650ng抗原。但潛在的問題是抗原表位會發生部分變性，結果造成所選擇的抗體并不識別天然抗原。盡管這并不常見，但仍可加以避免。可先用抗原特異性抗體包被此免疫管，或者用可溶性生物素化抗原在溶液中通過鏈霉親和素或親和素磁珠捕捉抗原及其所結合的噬菌體。
有兩種方法可有助于選擇到更高親和力的抗體。一種是在*輪后提高洗滌步驟的嚴謹性；另一種是在隨后的各輪選擇中降低抗原濃度。后種方法的前提是要用液相生物素化抗原的選擇方法。這是由于固相支持物上的抗原會產生以親和力為基礎的選擇。很典型的是，對于大容量無偏性的抗體文庫，所用的起始抗原濃度為300～500nmol/L，而在其后每一輪選擇時，抗原濃度都會降低5倍。
www.shjsbio.com
上一篇：用氯化銫離心法純化噬菌體
