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將抗原結(jié)合到抗體微珠基質(zhì)上的zui簡單方法是將微珠裝到一個層析柱內(nèi)，將抗原溶液流經(jīng)層析柱，當抗原流經(jīng)層析柱時結(jié)合到抗體上而被固定，直到洗脫時才洗脫下來。這種方法的效率是根據(jù)抗原與固定的抗體之間的接觸時間決定的，所以抗原抗體之間的作用時間可以用低流速而延長。
這種方法zui大一個問題就是某些蛋白非特異性結(jié)合到分離柱上，這些蛋白可以出現(xiàn)在洗脫液中，從而使純化效率降低。基質(zhì)本身和抗體基質(zhì)復(fù)合物具有與待檢抗原溶液中蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合的表面活性。雖然這些反應(yīng)較正常的抗原—抗體反應(yīng)要弱得多，但抗原溶液中如存在大量額外的非特異性蛋白即意味著在此過程中將產(chǎn)生內(nèi)在的高本底。為了盡可能減少非特異性吸附，可以采取以下幾種措施。
首先，如采用各種親和柱純化法，所用基質(zhì)的量須調(diào)整到略高于其飽和水平。保持抗體—微珠—基質(zhì)的體積，使非特異性本底盡可能降低。捕獲大量抗原所需抗體—微珠基質(zhì)的量與流速有關(guān)。流速較慢時，柱容量更有效，因為偶聯(lián)的抗體就有更多時間與抗原結(jié)合。
第二種方案是降低柱上的非特異性吸附量。許多吸附到柱基質(zhì)上的蛋白質(zhì)是部分或全部變性的蛋白。當制備抗原溶液時，機械性壓力應(yīng)盡可能小，并避免過度與空氣接觸。降低抗體柱上非特異結(jié)合的一種較好的方法是將抗原溶液通過一個未與抗體偶聯(lián)的瓊脂糖柱，此層析柱應(yīng)與抗體—微珠基質(zhì)柱體積相同或更大。另外一種引起非特異性結(jié)合的因素來自小顆粒碎片被阻留在柱基質(zhì)上。將抗原溶液經(jīng)過100 000g離心30min，可以去除制品中大多數(shù)較大的凝聚物。
第三種降低本底的方法是用緩沖液洗滌層析柱以去除非特異性蛋白。任何不干擾抗原抗體反應(yīng)的緩沖液都可以用于阻止非特異性結(jié)合。
