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凝膠電泳前的蛋白質烷化

2012-2-10  閱讀(2403)

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    1.如果使用經免疫沉淀法得到的蛋白,按常規洗滌免疫復合物。盡可能*去除zui后的洗液。如果使用其他來源的蛋白,則將其轉入20mmol/L的磷酸鹽溶液中(pH7.0),或直接在20/1l水中重懸蛋白。蛋白濃度應低于lmg/m1。
 
    2.加入20u1.5%SDS和20mmol/L DTI。
 
    3.加熱至85C10min,仔細將上清液移入另一試管。
 
    4.加入10rd新鮮配制的0.2mmol/LN-乙基順了烯二酰亞胺(NEM),12.5mg/m1的水溶液為飽和溶液),使用前臨時配制。85℃溫育10min,有利于NEM溶于溶液中。超聲水浴亦可起作用,但是重復抽吸即足以促溶。由于溶液是飽和的,*液化不可能。另外,可將NEM溶于20retool/L乙酸鈉中(pH 6.0)。
 
    5.置冰浴中60min。
 
    6.加入10ul 50%甘油,0.5mol/lp-巰基乙醇和0.001%的溴酚藍。
 
    至此樣品可以進行電泳。

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