細菌RNA提取試劑盒（DNase I）說明書

RNApure Bacteria Kit（DNase I）

細菌RNA提取試劑盒（DNase I）

Cat. No.   K0539

保存：DNase I、10×Reaction Buffer：-20℃

其它組分：室  溫

組分說明

                                              Cat. No.              k0539

                                              Kit Size                 50

                                              DNase I                1000 U

                                        10×Reaction Buffer           1000  μl

                                             Buffer RL               35 ml

                                            Buffer RW1               40 ml

                                    Buffer RW2（concentrate）          11 ml

                                        RNase-Free Water             10 ml

                                      Shredder Spin column             50

                                         Spin Column RM               50

                                    Collection Tube（1.5 ml）            50

                                     Collection Tube（2 ml）            100

產品簡介

    本試劑盒采用高效、專一結合核酸的離心吸附柱和*的緩沖系統，可從細菌或培養的動物細胞中快速提取總 RNA。30-40 分鐘內即可完成反應，提取的總 RNA 純度*，沒有蛋白質和其他污染，適用于 RT-PCR、Real-Time RT-PCR、芯片分析、體外翻譯等實驗。

注意事項

1.  預防RNase污染，應注意以下幾方面：

1）使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。

2）玻璃器皿應在使用前于180℃高溫下干烤4小時，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。

3）配制溶液應使用無RNase的水。

4）操作人員戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套。

2.  Buffer  RL 在使用前請加入β-巰基乙醇至終濃度為 1%，如 1 ml Buffer  RL 加 10 μl  β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的

Buffer RL 4℃可保存 1 個月，如出現沉淀，請加熱溶解后使用。

3.  第一次使用前應按照試劑瓶標簽的說明先在 Buffer RW2 中加入無水乙醇。

5.  如未特殊說明，所有離心步驟均在室溫下進行，且所有操作步驟動作要迅速。

自備試劑：Lysozyme（YJ0887）、β-巰基乙醇、無水乙醇（新開封或提取RNA專用）  

操作步驟

 1.   4℃  10,000 rpm（~13,400×g）離心2分鐘收集菌體（菌體量最大不超過1×10⁹ ），小心去除所有上清。

     注意：上清如果有殘留，會影響后續的消化過程。

 2.   用含有Lysozyme的100  μl TE緩沖液*重懸菌體，室溫孵育。具體配方和孵育時間如下：

TE 緩沖液中 Lysozyme 的終濃度                孵育時間

G 細菌                  400  μg/ml                 3-5 分鐘

                          -

G+ 細菌                 3 mg/ml                   5-10 分鐘

 3.   加入350  μl裂解液RL（使用前請檢查是否加入β-巰基乙醇），渦旋震蕩混勻（此步驟可能出現不溶性沉淀），將溶液與沉淀全部加入到已裝入收集管（Collection Tube 2 ml）的過濾柱（Shredder Spin Column）中，10,000 rpm離心 2分鐘。

 4.   向上步得到的濾液中加入250  μl無水乙醇，混勻（此時可能會出現沉淀）。將得到的溶液和沉淀一起轉入吸附柱（Spin Column RM）中（吸附柱已裝入2 ml收集管中），10,000 rpm離心1分鐘，棄掉廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

 5.   向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1，10,000 rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

 6.   配制DNase I  混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8  μl 10×Reaction Buffer 和20  μl DNase I（1U/μl），混勻，  配制成終體積為80 μl的反應液。

 7.   向吸附柱中直接加入80 µl DNase I  混合液，20-30℃孵育15分鐘。

 8.   向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1，10,000 rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

 9.   向吸附柱中加入500  μl Buffer RW2（使用前檢查是否加入無水乙醇）, 10,000 rpm離心1分鐘,棄廢液。

 10. 重復步驟9。

 11. 將吸附柱放回收集管中，10,000 rpm離心2分鐘。

     注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余乙醇去除，乙醇殘留會影響后續的酶促反應(酶切、PCR等)。

 12. 將吸附柱裝入新的RNase-Free的1.5 ml  收集管中，向吸附膜的中間加入30-50 μl RNase-Free Water，室溫放置1分鐘，10,000 rpm離心1分鐘，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

注意：1）  RNase-Free Water 體積不應小于 30 μl，體積過小影響回收率。

2）  如果要提高RNA的產量，可用30-50 μl新的RNase-Free Water重復步驟12。

3）  如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復步驟12。

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