尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG 酶）說明書

Uracil-N-Glycosylase

Cat. No.   K0951

保存：-20℃

組分說明

Cat.No.              K0951      K0951A

KitSize               200U      5×200U

 Uracil-N-Glycosylase，1U/μl        200 μl    5×200 μl

產品簡介

     尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶）也稱為尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG酶），通過大腸桿菌表達純化的重組酶，該蛋白分子量為25kD，可催化含尿嘧啶的單鏈和雙鏈DNA釋放游離尿嘧啶，并且對RNA無活性，主要應用于防止PCR擴增產物的污染。該酶作用機理為：在PCR反應中以dUTP代替dTTP，擴增產物片段中的T全部被U取代，形成了含dU堿基的PCR擴增產物。UNG酶能選擇性斷裂單鏈和雙鏈DNA中U堿基的糖苷鍵，降解反應體系中含U的DNA，有效消除PCR產物的殘留污染，大大降低擴增產物污染導致的假陽性，從而保證擴增的特異性和準確性。

單位定義

     37℃，60分鐘內催化1nmol尿嘧啶，從含尿嘧啶的DNA上釋放所需要的酶量定義為一個單位。

質量控制

     SDS-PAGE檢測純度大于95%；經檢測無核酸內、外切酶活性。

注意事項

1. UNG長期儲存(非頻繁使用; 每月少于3次)請置于-70℃保存，每天或每周使用請于-20℃保存。盡量避免反復凍融，大包裝建議分裝使用。

2.UNG可以在PCR反應前先清除不慎污染的U-DNA分子，一個實驗室必須在所有的PCR反應中使用dUTP作為dNTP之 一，使所有擴增產物都成為U-DNA。如單使用于某個檢測，T-DNA仍會積累，此抗污染系統也難以起到*的作用。

3. UNG/dUTP系統是PCR試劑內部的一種防污染措施，為了防止PCR產物的污染，尤其是在臨檢實驗室中反復放大同一片段時，必須嚴格規范實驗室的分劃和操作。  

使用方法

以下舉例為常規的反應體系和反應條件，實際操作中應根據具體實驗進行相應的改進和優化。

1.  PCR反應體系：

試劑                                  50μl反應體系               終濃度

TaqPCRBuffer，10×            5μl                           1×

dATP，10mM                       1μl                        200μM 

dGTP，10mM                       1μl                        200μM

dCTP，10mM                        1μl                         200μM

    

dTTP，10mM                        0.5 μl                    100μM

    

dUTP，10mM                        1μl                       200μM

    

ForwardPrimer，10μM          1μl                      0.2μM

ReversePrimer，10μM           1μl                      0.2μM

TemplateDNA                         Xμl                  

                                            ，

TaqDNAPolymerase                 5U/μl                   0.5μl                 

Uracil-N-Glycosylase，         1U/μl                 0.2μl                 

    

RNase-FreeWater                  upto50 μl              

    

    注意：TaqDNAPolymerase與Uracil-N-Glycosylase的反應緩沖液和酶儲存液可以通用。

2.  PCR 反應條件： 

     

步驟               溫度             時間

    

UNG消化                37℃-50℃                  5-10min

預變性              95℃             10min

變性                94℃             30s

退火               55-65℃           30s         30-40 個循環

延伸                          72℃             1min

延伸

    注意：通常將Taq酶與UNG酶按一定的比例加入終PCR反應體系中，先于72℃37℃-50℃范圍內消化 5min5-10分鐘，然后95℃10分鐘滅活，（同時這一步也達到預變性和熱啟動的效果），隨后進行PCR擴增。UNG酶的反應可以在37℃-50℃，5-10分鐘的范圍內變化，可以根據實驗的需要進行調整。

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