HiFiScript cDNA第--鏈合成試劑盒說明書

HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit

HiFiScript cDNA第--鏈合成試劑盒

目錄號：K2569

保存條件：-20℃保存。

組分說明

  Size                       25            100

HiFiScript，200 U/μl           25 μl         100 μl

5×RT Buffer                    120 μl        500 μl

Primer Mix                     60 μl         240 μl

dNTP Mix，2.5 mM Each              120 μl        500 μl

DTT，0.1 M                     60 μl         240 μl

RNase-Free Water                 1 ml          1 ml

本產品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途  

產品簡介

　　本產品是專為兩步法RT-PCR第--步實驗配制的cDNA第--鏈合成試劑盒。該試劑盒中使用的HiFiScript逆轉錄酶是M-MLV由來的新型高效逆轉錄酶，新穎突變位點大幅提升酶的轉錄活性， cDNA第--鏈合成的效率和產量更高，可利用    pg級的總 RNA或mRNA合成cDNA第--鏈。點突變消除RNase  H活性，酶的延伸性能提高，有效改善逆轉錄酶與RNA模板的親和力，可獲得長至12  kb的cDNA。精心優化的RT Buffer使逆轉錄酶應用范圍更廣，對后續的 PCR以及定量PCR實驗兼容性高。該試劑盒配備所有逆轉錄試劑，使用簡單方便。適用于第--鏈cDNA的合成和后續的RT-PCR、RT-qPCR，以及全長cDNA文庫的構建等。

產品特點

1．高效的逆轉錄效率：新穎突變位點大幅提升酶活性能，獲得更高產量的cDNA。

2．良好的延伸能力：點突變消除RNase H活性，改善逆轉錄酶與RNA模板的親和力，可獲得長至12 kb的cDNA。

3．靈敏度高：可利用pg級的總RNA或mRNA模板合成cDNA第--鏈。

4．使用方便：逆轉錄試劑盒中已配備所有逆轉錄試劑，僅需準備模板即可輕松完成逆轉錄。

注意事項

1．在操作過程中應避免RNase污染，防止RNA降解或實驗中的交叉污染，建議在專門的區域進行RNA操作，使用專門的儀器和耗材，操作人員帶口罩和一次性手套并經常更換手套。

2．實驗盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，應使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃處理12小時，并在120℃下高壓滅菌30分鐘后使用，或者將玻璃器皿在180℃下干熱滅菌60分鐘后使用。實驗中用到的無菌水應使用 0.1%的DEPC處理后進行高壓滅菌。

3．本試劑盒中的所有試劑使用前請上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經短暫離心后使用。所涉及的酶類使用后應盡快放回-20℃，避免反復凍融。

4．若起始RNA的量小于50 ng，建議加入RNA酶抑制劑（RNasin）。本試劑盒并未提供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：K0596。

使用方法

注意：1 ng-5 μg總RNA可建立20 μl反應體系，如果總RNA量大于5 μg，請按比例擴大反應體系。

逆轉錄操作步驟：

1．將RNA模板、Primer  Mix、dNTP  Mix、DTT、RT  Buffer、HiFiScript和RNase-Free  

   Water溶解并置于冰上備用。

2．根據以下表格配制反應體系，總體積為20 μl。

試劑                    20 μl反應體系            終濃度

dNTP Mix，2.5 mM Each         4 μl           500 μM Each

Primer Mix                 2 μl

RNA Template               X μl            50 pg-5μg

5×RT Buffer              4 μl              1×

DTT，0.1 M               2 μl            10 mM

HiFiScript，200 U/μl        1 μl

RNase-Free Water         up to 20  μl

    注意：1）若起始RNA的量小于50 ng，則建議加入RNA酶抑制劑（RNasin）。本試劑盒并未提供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：K0596。

    2）Primer Mix由Oligo(dT)和Random Primer配制而成。

3．渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。

4．42℃孵育30-50分鐘，85℃孵育5分鐘。反應結束后，短暫離心，置于冰上冷卻。

5．逆轉錄產物可直接用于PCR反應和熒光定量PCR反應，或置于-20℃長期保存。

ii  若逆轉錄效率低，或RNA模板二級結構復雜、GC含量高時，建議采用以下步驟：

1．將RNA模板、Primer  Mix、dNTP  Mix、DTT、RT  Buffer、HiFiScript和RNase-Free  

   Water溶解并置于冰上備用。

2．根據以下表格配制反應體系，總體積為13 μl。

試劑                      20 μl反應體系           終濃度

dNTP Mix，2.5 mM Each           4 μl              500 μM Each

Primer Mix                  2 μl

RNA Template                X μl               50 pg-5μg

RNase-Free Water             up to 13  μl

3．70℃孵育10分鐘，迅速冰浴2分鐘。

4．短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。

5．繼續向以上反應液中加入以下試劑：

試劑               20 μl反應體系            終濃度

5×RT Buffer           4 μl                   1×

DTT，0.1 M            2 μl                10 mM

注意：1）若起始RNA的量小于50 ng，則建議加入RNA酶抑制劑（RNasin）。本試劑盒并未提供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：K0596。

2）Primer Mix由Oligo（dT）和Random primer配制而成。

6．輕輕吹打混勻，42℃孵育2分鐘。

7．加入1 μl HiFiScript（200 U/μl），輕輕吸打混勻。42℃孵育50分鐘。

8．85℃孵育5分鐘。反應結束后，短暫離心，置于冰上冷卻。

9．逆轉錄產物可直接用于 PCR反應和熒光定量 PCR反應，加入量應小于 PCR反應體系的1/10，或置于-20℃長期保存。

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