Cytoskeleton，Inc.成立于1993年。自成立以來(lái)，我們一直在不斷擴(kuò)大產(chǎn)品范圍。

Cytoskeleton，Inc.很高興為藥物篩選，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞骨架研究提供廣泛的試劑盒和產(chǎn)品。我們專注于純化蛋白的生產(chǎn)和易于使用的試劑盒，以研究生化和細(xì)胞過(guò)程。我們的試劑盒既可用于基礎(chǔ)研究或小型篩查的少量樣品（Biochem Kits™），也可用于大型篩查的高通量規(guī)模（CytoDYNAMIX Screens™）。

除了我們現(xiàn)有的產(chǎn)品，我們還提供產(chǎn)品系列中微管，微管蛋白，運(yùn)動(dòng)蛋白，小G蛋白效應(yīng)物，GAP，GEF和其他幾種蛋白的藥物篩選服務(wù)。

cytoskeleton BK033-S說(shuō)明書

Arf6 Pull-down Activation Assay Biochem Kit (bead pull-down format) - 20 Assays

Amount

20 assays  (Cat. # BK033-S)

產(chǎn)品用途包括

• 分析體內(nèi) ARF6激活。
   

介紹

與Ras相關(guān)的小G蛋白的哺乳動(dòng)物ADP核糖基化因子（Arf）亞家族初被命名為具有刺激霍亂毒素介導(dǎo) 的許多GPCR使用的_Gsα亞基的ADP核糖基化的能力（1）。根據(jù)其大小和氨基酸相似性，將Arf GTPases分為三類：I類（Arf6和Arf3），II類（Arf4和Arf5）和III類（Arf6）。Arf6的主要作用之一是蛋白質(zhì)從質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)吞區(qū)室（例如GPCR），并且似乎在某些GPCR的順行轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用（3、4）。像Arf1一樣，Arf6部分地通過(guò)脂質(zhì)修飾酶的激活來(lái)改變局部膜環(huán)境（3）。

與其他小G蛋白一樣，Arf6在無(wú)效的GDP結(jié)合狀態(tài)和有效的GTP結(jié)合狀態(tài)之間循環(huán)。效應(yīng)蛋白與GTP結(jié)合的Arf6與GDP結(jié)合的狀態(tài)的優(yōu)先結(jié)合為Arf6在細(xì)胞中的功能提供了基礎(chǔ)。效應(yīng)蛋白與Arf6-GTP的這種高度特異性的聯(lián)系已被用于開發(fā)親和沉淀測(cè)定法以監(jiān)測(cè)Arf6的活化（5）。

細(xì)胞骨架的Arf6活化檢測(cè)法Biochem Kit™利用效應(yīng)蛋白GGA3（含有高爾基體的γ-耳，含有Arf結(jié)合蛋白3）的Arf6蛋白結(jié)合域（PBD），該蛋白已被證明與GTP結(jié)合形式Arf6（5，6）。我們已經(jīng)在大腸桿菌中共價(jià)結(jié)合了純化的GGA3-PBD（氨基酸1-316）試劑盒中提供的彩色瓊脂糖珠（圖1）。使用這些珠子，研究人員能夠使用該試劑盒中提供的Arf6特異性抗體，“下拉” Arf6-GTP并定量活性Arf6的水平，隨后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡步驟。該測(cè)定法提供了一種分析各種系統(tǒng)中細(xì)胞Arf6激活水平的簡(jiǎn)單方法。下面的圖2顯示了典型的Arf6下拉測(cè)定法，使用的是GTPγS和GDP負(fù)載的MDCK細(xì)胞提取物，或已經(jīng)收獲并保持懸浮狀態(tài)或鋪在纖連蛋白包被的培養(yǎng)皿中的MDCK細(xì)胞提取物（例如，參見參考文獻(xiàn)7， 8）。

試劑盒內(nèi)容
試劑盒包含足夠的材料，可用于20種測(cè)定，具體取決于測(cè)定的設(shè)置，并包括用于陽(yáng)性和陰性對(duì)照的試劑。包括以下組件：

1. GGA3-PBD磁珠（目錄號(hào)GGA05）
2. Arf6單克隆抗體（目錄號(hào)ARF06）
3. His標(biāo)記的Arf6蛋白
4. GTPγS：（不可水解的GTP類似物）（目錄號(hào)BS01）
5. 國(guó)內(nèi)生產(chǎn)總值
6. 細(xì)胞裂解液
7. 洗滌緩沖液
8. 加載緩沖
9. 停止緩沖區(qū)
10. 蛋白酶抑制劑混合物（目錄號(hào)PIC02）
11. 二甲基亞砜
12. 帶有詳細(xì)協(xié)議的手冊(cè)和詳盡的故障排除指南

結(jié)果示例

圖2顯示了典型的Arf6下拉測(cè)定法，使用的是GTPγS和GDP負(fù)載的MDCK細(xì)胞提取物，或者是已收獲并保持懸浮狀態(tài)或鋪在纖連蛋白包被的培養(yǎng)皿上的MDCK細(xì)胞提取物（例如，參見參考文獻(xiàn)7、8 ）。
 

圖2.  Arf6激活測(cè)定Biochem Kit™下拉測(cè)定結(jié)果。
 

上：  使用產(chǎn)品手冊(cè)第VI節(jié)：對(duì)照反應(yīng)中所述的方法，將裝有GTPγS（GTP泳道）或GDP（GDP泳道）的MDCK細(xì)胞裂解液（500 µg）裝滿。  

底部：  從懸液中懸浮2小時(shí)（Sus）或在組織培養(yǎng)板（Rp）上生長(zhǎng)的細(xì)胞獲得的MDCK細(xì)胞裂解物（500 ug）。所有提取物均與20μgGGA3-PBD珠一起孵育，并按照產(chǎn)品手冊(cè)第VI節(jié)：Pulldown分析中所述進(jìn)行處理。將所有珠子樣品重懸于20 µl 2x樣品緩沖液中，然后在4-20％SDS-PAGE凝膠上分離，轉(zhuǎn)移至PVDF，以1：250稀釋的抗Arf6抗體進(jìn)行探測(cè)，并按照所述方法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)在產(chǎn)品手冊(cè)的第六節(jié)：STEP 4中。

參考文獻(xiàn)

1. Kahn，RA，和Gilman，AG（1986），霍亂毒素對(duì)Gs進(jìn)行ADP-核糖基化的蛋白質(zhì)輔因子本身就是GTP結(jié)合蛋白。J.Biol。化學(xué) 261，7906-7911。
2. Tsuchiya，M.，Price，SR，Tsai，SC，Moss，J。和Vaughan，M。（1991）ADP-核糖基化因子mRNA的分子鑒定及其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。J.Biol。化學(xué) 266，2772-2777。
3. D'Souza-Schorey，C.和Chavrier，P.（2006）ARF蛋白：在膜運(yùn)輸及其他方面的作用。納特 牧師 細(xì)胞生物學(xué)。7，347-358。
4. Wang，G.和Wu，G.（2012）GPCR順行販運(yùn)的小GTPase調(diào)控。趨勢(shì)藥理學(xué)。科學(xué) 33，28-34。
5. Cohen，LA和Donaldson，JG（2010）分析Arf GTP結(jié)合蛋白在細(xì)胞中的功能。Curr。協(xié)議。細(xì)胞生物學(xué)。48，14.12.1-14.12.17。
6. Takatsu，H.，Yoshino，K.，Toda，K.和Nakayama，K.（2002）GGA蛋白通過(guò)其GGAH結(jié)構(gòu)域和ADPribosylation因子之間的相互作用與高爾基膜結(jié)合。 生化。J.  365，369-378。
7. Balasubramanian，N.，Scott，DW，Castle，JD，Casanova，JE和Schwartz，M.A.（2007）Arf6和微管在脂筏的黏附依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)中。納特 細(xì)胞生物學(xué)。9，1381-1391。
8. Goldfinger，LE，Ptak，C.，Jeffery，ED，Shabanowitz，J.，Hunt，DF，和Ginsberg，MH（2006）RLIP76（RalBP1）是一種R-Ras效應(yīng)子，介導(dǎo)粘附依賴性Rac活化和細(xì)胞遷移。J.細(xì)胞生物學(xué)。174，877-888。