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背景介紹

在藥物疫苗生產中，需要對起始、中間和最終產品的抗原水平進行控制。用以檢測衰減或失活的病毒或細菌數量。由于這些抗原通常由蛋白質組成，總蛋白的分析定量是一種可選方法。

《藥典》規(guī)定了許多相關方法，其中包括幾種紫外/可見分光光度法（如Lowry法、Bradford法、BCA法）以及兩種總氮法，即凱氏定氮法和催化燃燒法。本應用說明重點介紹了歐洲藥典Pharm. Eur. 2.5.33, Method 7 B催化燃燒法：氮化合物在氧氣中高溫裂解為一氧化氮（NO），然后通過化學發(fā)光檢測器（CLD）進行檢測。此方法描述幾乎與EN 12260一致，后者描述了環(huán)境水中TNb的測定。 multi N/C分析儀既是如此設計，因此也可用于醫(yī)藥產品中TNb的測定。TNb可以轉化為總蛋白來確定其抗原的水平。

由于蛋白質的含氮量不同，根據以下公式乘以系數6.25，將總氮濃度轉換為總蛋白質濃度已被廣泛接受：

C [總蛋白] = c [TN] x 6.25  

儀器

表1： 分析儀說明：multi N/C 2100S

樣品和試劑

在客戶現場制備的5個尿素TNb校準標準、1個BSA對照標準品和3個未知的客戶樣品，測定三次。分析前，樣品在4℃下制冷劑中保存。

恢復至室溫室后，用微量移液管將液體樣品直接轉移到2毫升樣品瓶中，并蓋上瓶蓋。由自動進樣器取樣75μL樣品直接注射進燃燒爐中。在鉑催化劑的作用下，所有氮化合物在純氧環(huán)境中通過高溫燃燒催化轉化為一氧化氮（NO），隨后由化學發(fā)光檢測器（CLD）定量檢測NO。

測樣順序、自動攪拌及洗針設置均由AS60自動進樣器控制完成。

校正

采用BSA蛋白質標準溶液配置5 – 60 mg/L系列總氮（TNb）多點校準標樣。200mg TN/L BSA儲備溶液（Sigma Art.Nr. A-7906，白蛋白，牛氮含量為15.60%，純度為98%），稱重128.2mg，用超純水定容至100mL。此類樣品中從測定的氮含量計算蛋白質濃度的標準轉換因子（在文獻中找到）為6.25。

校正曲線

圖1：TN示例 – BSA校正曲線和特征范圍5-60mg/L N

結果和討論

每個樣品至少測定三次。

結論

所有樣品都得到了很好的重復性，RSD值很低。

采用微量注射器進樣，從樣品瓶到燃燒爐的距離短，直接注射無傳輸管路和閥門。樣品消耗量極少，3次潤洗，5次75μL重復測試，樣品消耗總體積不超過1.5mL。

配置CLD檢測器的multi N/C分析儀是進行總氮測定的最佳分析系統(tǒng)，遵循Pharma Eur. 2.5.22 method 7 B。客戶的校準標準品和檢查標準（BSA）的回收率佳，樣品峰型多次測量均無偏移重復性好，且無拖尾，充分證明了儀器性能。