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定量PCR儀的關(guān)鍵參數(shù)和重要特性
熒光定量PCR儀的關(guān)鍵參數(shù)和重要特性 在選購(gòu)熒光定量PCR儀時(shí)，幾個(gè)關(guān)鍵參數(shù)要注意：
1.儀器的檢測(cè)通量（Throughput）
首先要考慮實(shí)驗(yàn)室目前需要使用定量PCR儀的頻率。加州大學(xué)舊金山分校癌癥中心的基因組分析設(shè)備負(fù)責(zé)人David Ginzinger檢測(cè)過(guò)市面上絕大多數(shù)的定量PCR儀。他表示，如果不是大規(guī)模批量使用，比如說(shuō)主要是用來(lái)檢測(cè)驗(yàn)已知基因，那確實(shí)不需要昂貴的端產(chǎn)品。但是如果是那些需要尋找新藥靶點(diǎn)和疾病標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)室，就需要能容納384孔板、運(yùn)行時(shí)間更快的儀器。不過(guò)僅有這么一件高通量的儀器是不夠快的，你會(huì)發(fā)現(xiàn)樣品制備成為限速的瓶頸。所以高通量的實(shí)驗(yàn)室往往需要進(jìn)一步的自動(dòng)化儀器，只要“按一下鈕”，儀器就會(huì)自動(dòng)處理樣品、純化核酸和制備PCR模板。
2.多重?cái)U(kuò)增的能力
多重?cái)U(kuò)增越來(lái)越熱。實(shí)時(shí)定量PCR儀也不能幸免。端定量PCR儀擁有多個(gè)檢測(cè)通道，因而儀器就可以檢測(cè)同一個(gè)樣品槽里多個(gè)模板的擴(kuò)增過(guò)程。新的LightCycler2.0 有6個(gè)檢測(cè)通道，比原來(lái)多了3個(gè)。SmartCyclerⅡ有4個(gè)檢測(cè)通道。以文庫(kù)產(chǎn)品而名滿天下的Stratagene也有一種價(jià)格不到Roche的一半、口碑不錯(cuò)的定量PCR儀Mx3000P，也就是4個(gè)檢測(cè)通道。不過(guò)多重?cái)U(kuò)增并非人人適用，因?yàn)樗箤?shí)驗(yàn)復(fù)雜化了。
3．軟件
當(dāng)你準(zhǔn)備選擇一臺(tái)定量PCR儀，你必須要檢測(cè)附帶的軟件。使用方便嗎，是否可以進(jìn)行你所需要的分析，輸出格式有幾種。不過(guò)，你需要留意，太容易使用的軟件是不是功能比較簡(jiǎn)單而無(wú)法進(jìn)行復(fù)雜計(jì)算，以前的軟件還需要你做進(jìn)一步分析，新的軟件已經(jīng)可以處理一切了。除了基本功能，部分軟件還可以有更多的功能，比如引物和探針設(shè)計(jì)、多重分析設(shè)計(jì)、背景校正、數(shù)據(jù)歸一化等等。Roche應(yīng)用科學(xué)部的應(yīng)用和技術(shù)服務(wù)部負(fù)責(zé)人Willian Demyan 就強(qiáng)調(diào)：定量PCR是一個(gè)幾何擴(kuò)增的過(guò)程，開(kāi)始時(shí)一個(gè)拷貝之差，結(jié)果就有幾何數(shù)量級(jí)之別。
4.靈活性
大規(guī)模繁忙的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備*固然令人羨慕，常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室同樣可以有精彩的選擇。現(xiàn)在的供應(yīng)商都擁有眾多的技術(shù)專家，不單了解你的目前需要，還非常周到地為你考慮了以后可能的需求變化，比如提供多種可升級(jí)配件和模塊。BioRad的MyCycler就可以選擇模塊而升級(jí)為實(shí)時(shí)定量。ABI的定量PCR儀有多種不同的樣品槽，可以將96孔槽變?yōu)殡p384孔槽而滿足部分高通量的需求。對(duì)于剛開(kāi)始小量做qPCR的實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，SmartCyclerⅡ定量PCR儀是一個(gè)好選擇，一個(gè)基本模塊有16個(gè)獨(dú)立控溫樣品槽，可以同時(shí)或者前后分別進(jìn)行16個(gè)*獨(dú)立的不同實(shí)驗(yàn)， “隨機(jī)存取”；當(dāng)實(shí)驗(yàn)室需要較大規(guī)模實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以非常經(jīng)濟(jì)地升級(jí)，從1個(gè)增加到6個(gè)基本模塊，也就是96樣品孔。雖然不能用96孔板，但是當(dāng)一個(gè)學(xué)生開(kāi)始小量實(shí)驗(yàn)，其他人還可以隨時(shí)插進(jìn)去開(kāi)始自己的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，而且互不干擾，就是增加了靈活性。對(duì)于剛開(kāi)始只做少量實(shí)驗(yàn)而且預(yù)算較緊張的實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)是非常靈活的選擇。
5.不確定性
盡管軟件可以做部分修正，購(gòu)買一臺(tái)系統(tǒng)誤差較少的儀器，無(wú)需那么多計(jì)算修正總比靠計(jì)算修正好。Cinzinger 就認(rèn)為，要特別注意儀器樣品孔之間的差異性。除了*的樣品孔之間的溫度差異，還有樣品孔和檢測(cè)探頭之間光程距離、負(fù)責(zé)收發(fā)和傳遞信號(hào)的光纖長(zhǎng)度的微小差別、透鏡和樣品孔間的距離和角度的微小差別、甚至樣品槽對(duì)信號(hào)傳遞的影響。Cinzinger在絕大多數(shù)的市售的定量PCR儀做過(guò)同樣的測(cè)試，他將同樣的樣品和反應(yīng)試劑在儀器的每一孔進(jìn)行實(shí)時(shí)擴(kuò)增。很不幸，很多時(shí)候，不同樣品孔之間會(huì)有不同的結(jié)果。
6.試劑盒的選擇
盡管銷售人員會(huì)吹噓有出色質(zhì)量控制的試劑盒和解決方案就會(huì)得到一至的結(jié)果，但購(gòu)買現(xiàn)成的試劑盒并不是解決差異性的辦法。認(rèn)真的評(píng)估實(shí)驗(yàn)和分析實(shí)驗(yàn)才是解決之道。