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數(shù)字PCR應用及前景
一． PCR的發(fā)展歷史
PCR技術自問世以來，在遺傳病、病原體、癌基因等分子診斷領域和法醫(yī)鑒定等方面發(fā)揮了巨大作用。代 PCR在進行擴增后通過凝膠電泳進行定性分析。
隨著生物分子熒光技術的發(fā)展，1992年實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR) 應運而生。qPCR是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質熒光強度來測定每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環(huán)后產物總量的方法。由于在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關系，所以Ct值也就成為定量的依據(jù)。基于熒光探針或染料的第二代 PCR 技術隨后逐漸發(fā)展為檢測核酸目標片段的主流分子診斷學技術。
在實時定量 PCR（qPCR） 過程中，熒光信號隨著擴增產物的積累而增強。qPCR 能夠實時獲得模板擴增的熒光值，然后根據(jù)DNA 模板在指數(shù)增長時期的 Ct 值與標準 DNA 的Ct值比較來計算初始模板的濃度。但是這種方法由于是大體積反應系統(tǒng)，非特異性的擴增增加了假陽性結果和背景信號，因此，終無法獲得定量的結果。
隨著MEMS工藝的不斷成熟和微流控技術的不斷發(fā)展，新一代PCR技術，數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR) 也隨之出現(xiàn)。digital PCR是一種新的定量PCR，主要是對PCR反應物進行有限稀釋，隨后在不同的反應腔室里進行PCR擴增，后根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度的技術。
圖1. PCR技術的發(fā)展歷程
二． 數(shù)字微流控（dPCR）的原理
20 世紀末，Vogelstein 等提出數(shù)字PCR( digitalPCR，dPCR) 的概念，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA 模板) ，在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR 擴增，擴增結束后對各個反應單元的熒光信號進行統(tǒng)計學分析。
dPCR是一種核酸分子定量技術。
dPCR一般包括兩部分內容，即PCR擴增和熒光定量分析。
在PCR 擴增階段，與傳統(tǒng)技術不同，dPCR一般需要將樣品稀釋到單分子水平，并平均分配到幾萬個反應腔室里反應。這樣子相當于變相的對靶基因進行富集。與此同時，由于對原樣品的大幅度的稀釋，使得PCR抑制劑濃度顯著降低，這樣dPCR對初始PCR反應物里抑制劑的要求顯著低于qPCR。
不同于 qPCR對每個循環(huán)進行實時熒光測定的方法，dPCR 技術是在擴增結束后對每個反應單元的熒光信號進行采集，后根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。
圖2. dPCR基本原理
三. dPCR與qPCR的對比
相對于熒光定量PCR（qPCR）而言，dPCR具備以下優(yōu)勢：
1、 靈敏度可達單個核酸分子：檢測限低至0.001%，原因在于dPCR可以實現(xiàn)靶標DNA/RNA的富集；
圖3. dPCR可以實現(xiàn)痕量核酸的高靈敏檢測
2、 無需標準品（標準曲線），即可對靶分子起始量進行定量；
3、 特別適合基質復雜樣品的檢測：終點PCR檢測，不依賴Ct值，不依賴擴增效率，能克服PCR抑制劑的影響，適合動血樣、FFPE組織、糞便、尿液、痰液、水樣、土壤、植物等復雜樣品中DNA的定量；
4、 能夠有效區(qū)分濃度差異（變化）微小的樣品：更好的準確度、精密度和重復性，可以用于測定靶基因的相對表達，基因拷貝數(shù)變異分析等。