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在混懸液中結(jié)合：抗體-微珠勻漿法
閱讀：1603 發(fā)布時間：2012-8-29這是一種使抗體-微珠基質(zhì)快速捕獲抗原的方法，將抗原溶液與微珠混合，攪拌或振蕩制成勻漿。這種方法可使抗原與固相化的抗體zui大限度地接觸。結(jié)合反應(yīng)完成后，將勻漿裝入層析柱內(nèi)，以便收集結(jié)合有抗原的抗體-微珠和洗脫抗原。此法可以很好地控制反應(yīng)時間，充分的利用了抗體結(jié)合容量。這比上面介紹的直接用層析柱捕獲抗原方法麻煩一些。主要是因為用勻漿裝柱比較困難；另一個問題是在混勻過程中會增加抗原溶液中變性蛋白的量，所以使用這種方法的純化效果可能要差一些。
準(zhǔn)備工作
在開始工作前，要考慮裝填微珠的層析柱的類型及大小。既要考慮容易獲得陡峭的洗脫峰，又要方便勻漿裝柱。
溶液和特殊設(shè)備
1. 結(jié)合緩沖液（通常為PBS）
2. 搖床和簡單的層析設(shè)備
操作步驟
1. 將抗體-微珠基質(zhì)加入抗原溶液內(nèi)。所加微珠的體積應(yīng)通過預(yù)試驗確定，調(diào)整微珠的用量，使其在結(jié)合反應(yīng)所需時間內(nèi)能夠結(jié)合所有的抗原。微珠的zui終濃度大約為lml濕珠加到10~20ml溶液中。
2. 4℃孵育微珠-抗原勻漿，并輕輕混合。常用的方法是在一封閉的容量中振蕩或置平板搖床上渦旋混勻。孵育時間根據(jù)步驟1的預(yù)試驗確定，預(yù)試驗時可以從孵育2h開始。
3. 將微珠勻漿轉(zhuǎn)移到合適大小的層析柱中。將勻漿倒入柱內(nèi)，并用抗原稀釋緩沖液洗下混合容器中殘留的微珠，將洗滌液一道加入柱內(nèi)。
4. 用20倍柱床體積的結(jié)合緩沖液（即PBS）洗滌微珠。
此時制備好的層析柱可進(jìn)行進(jìn)一步洗滌或洗脫（見下述）。
常見問題與解決方法
這種方法zui大的問題是蛋白質(zhì)非特異地結(jié)合到微珠上。這些蛋白可在洗脫時出現(xiàn)，從而使純化效率降低。基質(zhì)本身和抗體-基質(zhì)復(fù)合物表面都可以非特異地結(jié)合抗原溶液中的蛋白質(zhì)，盡管這些反應(yīng)一般要比抗體-抗原間的反應(yīng)弱，但在待純化的抗原制品中有過量的非特異性蛋白就將影響純化效果。
以下幾種方法可使非特異性結(jié)合降到zui低限度。
首先，如同其他親和層析法一樣，所用基質(zhì)的量必須調(diào)整到剛好在其結(jié)合純化制品中所有抗原的水平上，使純化后的抗原溶液中非特異性蛋白的量盡可能降低。微珠的用量可通過預(yù)試確定，并可以測定不同體積的抗體-微珠基質(zhì)捕獲抗原的量。
第二種方法是降低層析柱的非特異性吸附量。許多吸附到柱基質(zhì)上的蛋白質(zhì)是部分或全部變性的蛋白。在制備抗原溶液時，機(jī)械性應(yīng)力要盡可能小。在結(jié)合階段，用機(jī)械振動使微珠保持混懸狀時，動作亦應(yīng)盡可能輕，并避免過度與空氣接觸。另一種非特異性吸附是由于某些顆粒性物質(zhì)，在將微珠轉(zhuǎn)移到柱中后，可被柱基質(zhì)截留。在將抗原溶液加入微珠之前，先將抗原溶液經(jīng)過100000′g離心30min，可去除制品中的顆粒物質(zhì)。
第三種降低洗脫液中其他非特異性蛋白的方法是在裝好柱后用緩沖液洗滌微珠，以去除非特異性蛋白。任何不干擾抗原抗體反應(yīng)的緩沖液都可以用于消除非特異性結(jié)合。