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RACE技術(shù)的原理
閱讀：4072 發(fā)布時間：2011-11-11RACE技術(shù)日益完善，目前己有商業(yè)化RACE技術(shù)產(chǎn)品推出，如CLONTECH的MarathoTM技術(shù)和SMARTTM RACE技術(shù)。邢桂春等（2001）先后使用上述兩種試劑盒進行RACE反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用MarathonTM所得到的片斷總是比采用SMARTTM RACE試劑盒到所得到的片斷短。其原因在于MarathonTM技術(shù)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)往往不能真正達到mRNA的5' 末端。所以認(rèn)為，進行RACE反應(yīng)應(yīng)當(dāng)優(yōu)選SMARTTM RACE試劑盒。以下就國內(nèi)目前應(yīng)用zui廣的SMARTTM RACE試劑盒為例，簡要概述RACE技術(shù)的原理和操作過程。
利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作為一個引物結(jié)合位點，以連有SMART寡核營酸序列通用接頭引物的Oligo（dT）30MN作為鎖定引物反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)*鏈cDNA.然后用一個基因特異引物GSP1（gene specific primer，GSP）作為上游引物，用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作為下游引物，以cDNA*鏈為模板，進行PCR循環(huán)，把目的基因3' 末端的DNA片段擴增出來。
SMARTTM 5'-RACE的原理
先利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作為一個引物結(jié)合位點，以O(shè)ligo（dT）30MN作為鎖定引物在反轉(zhuǎn)錄酶MMLV作用下，反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)*鏈cDNA.利用該反轉(zhuǎn)錄酶具有的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在反轉(zhuǎn)錄達到*鏈的5'末端時自動加上3-5個（dC）殘基，退火后（dC）殘基與含有SMART寡核苷酸序列Oliogo（dG）通用接頭引物配對后，轉(zhuǎn)換為以SMART序列為模板繼續(xù)延伸而連上通用接頭（見Figure 2 ）。然后用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作為上游引物，用一個基因特異引物2（GSP 2 genespecific primer，GSP）作為下游引物，以SMART*鏈cDNA為模板，進行PCR循環(huán)，把目的基因5'末端的cDNA片段擴增出來。zui終，從2個有相互重疊序列的3'/ 5'-RACE產(chǎn)物中獲得全長cDNA，或者通過分析RACE產(chǎn)物的3'和5'端序列，合成相應(yīng)引物擴增出全長cDNA。
實驗中發(fā)現(xiàn)，做RACE反應(yīng)實驗實際操作中仍存在不少困難。因此，對RACE反應(yīng)條件進行反復(fù)摸索是十分必要的。這是因為：
*，在5'-RACE包含了有3個連續(xù)的酶反應(yīng)步驟（反轉(zhuǎn)錄、同聚物加尾和PCR擴增），每一步都可能導(dǎo)致失敗；
第二，擴增DNA末端的特異性*依賴錨定引物及擴增DNA模板樣品的不均一性，因而特異性一般很低，常呈現(xiàn)不清晰的成片條帶或截短的產(chǎn)物背景。因此，使用RACE技術(shù)擴增得到的特異末端片段，所獲得的重組克隆能夠全部測序，以排除RACE實驗結(jié)果中擴增產(chǎn)物假陽性和假陰性，zui終有可能獲得新基因的全序列。
隨著RACE的不斷改進和完善，優(yōu)化條件下PCR擴增效率和忠實性的提高及PCR產(chǎn)物克隆技術(shù)的迅速發(fā)展，RACE必將在基因克隆及基因表達研究中發(fā)揮越來越大的作用。
RACE的另一種代表方法-Self-Ligation法
1. 反轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng)。
2. Hybrid RNA的分解。
3. 單鏈cDNA的自身連接。
4. PCR擴增5'未知區(qū)域。
5. 目的DNA片段的切膠回收。
6. DNA序列測定。
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