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ELISA試劑盒酶標(biāo)記抗體方法主要有哪些?
閱讀：2807 發(fā)布時(shí)間：2018-4-13 ELISA試劑盒酶標(biāo)記抗體方法主要有兩種：戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鹽氧化法。
1、戊二醛交聯(lián)法：
戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，它可以使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過(guò)它而聯(lián)接。堿性磷酸一般用此法進(jìn)行標(biāo)記。交聯(lián)方法分一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應(yīng)后既得酶標(biāo)記抗體。
ELISA試劑盒中常用的酶一般都用此法交聯(lián)。它具有操作簡(jiǎn)便、有效（結(jié)合率達(dá)60%~70%）和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，酶與抗體交聯(lián)時(shí)分子間的比例不嚴(yán)格，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。在兩步法中，先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。也可先將抗體與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結(jié)。兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結(jié)合的，較一步法的酶結(jié)合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯(lián)的有效率較一步法低。
2、過(guò)碘酸鹽氧化法：
本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過(guò)氧化物酶的標(biāo)記常用此法。反應(yīng)時(shí)，過(guò)碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合。酶標(biāo)記物按克分子比例聯(lián)結(jié)，其*比例為：酶：抗體=1~2：1。此法簡(jiǎn)便有效，一般認(rèn)為是HRPzui可取的標(biāo)記方法，但也有人認(rèn)為所有試劑較為強(qiáng)烈，各批實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重演。
按以上方法制備的酶結(jié)合物一般都混有未結(jié)合物的酶和抗體。理論上，結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA試劑盒中zui后的酶活性測(cè)定，因經(jīng)過(guò)*洗滌，游離酶可被除去，并不影響zui終的顯色。但游離的抗體則不同，它會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，從而減少了結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體的量。因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測(cè)，效果更好。
結(jié)合物制得后，在用作ELISA試劑盒前尚需確定其適當(dāng)?shù)墓ぷ鳚舛取Ｊ褂眠^(guò)濃的結(jié)合物，既不經(jīng)濟(jì)，又可使本底增高；結(jié)合物的濃度過(guò)低，則又影響檢測(cè)的敏感性。所以必須對(duì)結(jié)合物的濃度予以選擇。zui適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至一定濃度時(shí)，能維護(hù)一個(gè)低的本底，并獲得測(cè)定的*靈敏度，達(dá)到zui合適的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。就酶標(biāo)抗體本身而言，它的有效工作濃度是指與其相應(yīng)抗原包被的載體作試驗(yàn)時(shí)，能得到陽(yáng)性反應(yīng)的zui高稀釋度。
