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細(xì)胞組織蛋白提取方法
閱讀：442 發(fā)布時(shí)間：2015-7-15| 提 供 商 | 上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司 | 資料大小 | 139KB |
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細(xì)胞組織蛋白提取方法
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一、 試劑盒說(shuō)明
SDS 裂解液(SDS Lysis Buffer)是一種比較強(qiáng)烈的細(xì)胞組織裂解液。SDS 裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用于常規(guī)的
Western、ChIP(染色質(zhì)免疫共沉淀)等。SDS 裂解液的主要成分為 50mM Tris(pH8.1)，1% SDS 以及多種蛋白酶及磷酸 酶抑制劑。可以有效抑制蛋白降解。
用 SDS 裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用 BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。由于含有較高濃度的去垢劑等 干擾物質(zhì)，不建議使用 Bradford 法測(cè)定由本裂解液裂解得到樣品的蛋白濃度。
應(yīng)用方面：可以用于 PAGE，Western，免疫沉淀（immunol precipitation，IP）等。
二、 試劑盒組份
組份 | KGP706 | KGP706-100 | 儲(chǔ)存溫度 |
SDS 裂解液 | 50 ml | 100 ml | 2-8℃ |
三、操作步驟
Ⅰ 實(shí)體組織蛋白的提取
1． 在每 mL 冷 SDS 裂解液加入 10μL 100mM PMSF，混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用。
2． 每 100mg 固體組織置于培養(yǎng)皿中，手術(shù)剪剪碎成 3mm×3mm 左右的小塊，加入 0.5～1 mL 冷 SDS 裂解液（如 裂解不充分可適當(dāng)添加較多的裂解液；如需要高濃度的蛋白樣品，可適當(dāng)減少裂解液用量），玻璃勻漿器上下手 動(dòng)勻漿 15 次，直至充分裂解，注意低溫操作；
3． 充分裂解后，將組織勻漿液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管， 10000 轉(zhuǎn)/分，4℃離心 5 min；
4． 取上清轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷的離心管中，蛋白定量（BCA 法）；
5． 分裝保存于-70℃,避免反復(fù)凍融，即可進(jìn)行后續(xù)的 Western、ChIP 等操作。
Ⅱ 培養(yǎng)細(xì)胞蛋白提取
1．在每 mL 冷 SDS 裂解液加入 10μL 100mM PMSF，混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用。
2．收集細(xì)胞，加入裂解液。
2.1 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基后，加入 10mL/150mm 培養(yǎng)板的冷 PBS 洗兩次，每次振搖數(shù)次以盡量去除培養(yǎng) 液；加入上述適量配制好的 SDS 裂解液（加量參見(jiàn)下表），用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。
2.2 懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞（或用細(xì)胞刮子刮下的貼壁細(xì)胞），將細(xì)胞及培養(yǎng)液移至離心管中， 1000 轉(zhuǎn)/分離心 10 min， 再用 10mL/150mm 培養(yǎng)板的冷 PBS，1000 轉(zhuǎn)/分離心 5 min 洗兩次； 細(xì)胞洗滌后，轉(zhuǎn)至新的預(yù)冷的離心管中， 加入上述適量配制好的 SDS 裂解液（加量參見(jiàn)下表），置于 4℃搖床平臺(tái)上，溫和振蕩 15 min；
3． 充分裂解后（充分裂解后應(yīng)沒(méi)有明顯的細(xì)胞沉淀）， 組織勻漿液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管， 10000 轉(zhuǎn)/分，4℃離心
5 min；
4． 取上清轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷的離心管中，蛋白定量（BCA 法）；
5． 分裝保存于-70℃,避免反復(fù)凍融，即可進(jìn)行后續(xù)的 PAGE、Western、ChIP 等操作。
RIPA 裂解液(弱)加量參考
細(xì)胞數(shù)量 | SDS 裂解液加入量 |
107 個(gè) | 0.5 mL～1 mL |
5×106 個(gè) | 0.2 mL～0.5 mL |
四、注意事項(xiàng)
? 需自備 PMSF。
? 所有接觸樣品的用具及試劑均需預(yù)冷。裂解蛋白的所有步驟都需在冰浴或 4℃進(jìn)行
? 提取蛋白后，如有必要，可透析除去表面活性劑。
? 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。