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western blot 常見問題及解決辦法
閱讀：2566 發布時間：2019-10-29我們在做WB時zui常遇到的問題也是驚人的相似——樣品漂浮、蛋白條帶扭曲（無法準確判斷蛋白分子量）、轉膜后看不到帶藍色或橙色的指示條帶、抗體孵育不均勻導致曝光度差異很大（依然是會影響到蛋白表達量的估算）。
這些問題其實都或多或少與樣品前處理有關。也就是說，我們*可以通過優化樣品處理手法，以及經驗累積，來獲得的WB結果。
1.出現樣品漂浮怎么辦？？
原因分析：樣品中含有未除凈的溶劑或雜質，其密度比電泳緩沖液小
解決辦法：處理組織或菌體時，需充分分散或裂解，確保目的蛋白盡可能的釋放；
熱處理粗樣時，確保升溫迅速，并且金屬浴或水溫的實際溫度達到100℃（在海拔較高處水的沸騰不能確保溫度）；
離心的轉速和時間足夠；
吸取上清液時盡量不要碰到中間層
2.蛋白條帶出現扭曲怎么辦？
原因分析：分離膠的濃度與蛋白分子量不對應；灌膠時間過長或過短，導致丙烯酰胺的交聯度不均勻
解決辦法：根據目的蛋白的分子量選擇正確的分離膠濃度；
制備分離膠與濃縮膠時，應保證緩沖液母液的正確稀釋，以及各組分的充分混勻（僅用移液器吹吸是不夠的，可以迅速用磁力攪拌器進行混勻）
3.轉膜后沒有指示條帶怎么辦?
原因分析：如果此時SDS-PAGE膠上也沒有指示劑，則表明轉膜時間過長，蛋白穿膜（此時就沒有再繼續做下去的必要了）
解決辦法：注意控制轉膜時間；
電泳液反復使用也可能導致轉膜失敗
4.抗體孵育不均勻怎么辦？
原因分析：孵育時振蕩搖床轉速過快，或是混勻直徑不夠，導致孵育不充分或不均勻
解決方法：確保搖床可以在50 rpm穩定運行；選擇振蕩直徑在5~10 mm范圍內的搖床