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技術(shù)文章

常見細(xì)菌染色方法

閱讀:1000          發(fā)布時間:2024-7-17

       常見的染色方法包括簡單染色、負(fù)染色、革蘭氏染色、芽孢染色法、鞭毛染色、莢膜染色。制備細(xì)菌染色片一般要經(jīng)過涂片、固定、染色、水洗、干燥等步驟,然后用顯微鏡甚至油鏡觀察。


1. 簡單染色:


       不同細(xì)菌或由于觀察者所側(cè)重觀察的內(nèi)容不同,所使用的染料也有差異,但簡單染色的方法是一樣的。先按照上述的制片方法制片,制成需要觀察的玻片后,使用相對應(yīng)的染料滴加到玻片上的菌膜區(qū)域,以覆蓋菌膜為準(zhǔn)。按照不同染料的要求,結(jié)合所觀察的內(nèi)容確定染色時間,染色時間到達(dá)時進(jìn)行水洗,干燥等步驟。最后得到的玻片加蓋蓋玻片即可進(jìn)行鏡檢。如有需要可以后續(xù)再進(jìn)行油封、蠟封等封片過程。

2. 負(fù)染色:


        制備觀察圖片是非常容易的,但對初學(xué)者來說想要在玻片中找到目標(biāo)菌還是有一定難度的,因為細(xì)菌常常無色透明且較小,所以對初學(xué)者來說除非對光圈等進(jìn)行很精細(xì)的調(diào)節(jié),否則很難觀察到目標(biāo)菌,因此進(jìn)行負(fù)染色就十分重要。該方法是將微生物與苯胺黑混合,再將混合物覆蓋于載玻片表面,由于這兩種天然黑色染料不能滲入微生物細(xì)胞,所以使得透明的微生物個體在黑色的背景下很容易觀察。

 

負(fù)染色法常見有兩種操作方法。

① 在一個載玻片上將微生物與異地苯胺黑混合,用另外的載玻片將混合物均勻的覆蓋于原來的載玻片上。該方法的目的是使混合物在在玻片上一邊厚一邊薄,在厚與薄中間的額區(qū)域就是最佳觀察區(qū)域。

② 用一接種環(huán)苯胺黑與微生物混合,用接種針在載玻片的中央將混合物延伸很小的區(qū)域。

3. 革蘭氏染色:


        革蘭氏染色是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法。細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫染色,而后經(jīng)碘液進(jìn)行媒染,之后用酒精脫色,在一定條件下有的細(xì)菌媒染后的顏色不會脫去,有的可以被脫去,前者叫做革蘭氏陽性菌,后者為革蘭氏陰性菌。為方便進(jìn)一步觀察,脫色后再用堿性蕃紅進(jìn)行復(fù)染,陽性菌仍為紫色,陰性菌染成紅色,這就是革蘭氏染色的原理。

其步驟包括初染、媒染、脫色、復(fù)染四個步驟。

4. 芽孢染色法:

 
        部分細(xì)菌能產(chǎn)生內(nèi)孢子,這些孢子能抵制細(xì)菌染色液的進(jìn)入,在革蘭氏染色法涂片染色時,革蘭氏陽性菌的芽孢呈現(xiàn)無色。雖然芽孢在革蘭氏染色片中可以看到,但在不易清晰觀察時,可用特殊的芽孢染色法,使芽孢與菌體呈現(xiàn)不同顏色,便于觀察。主要的芽孢染色法有孔雀綠染色法和石碳酸復(fù)紅染色法。


5. 鞭毛染色法:


        鞭毛是細(xì)菌的運動器官,非常纖細(xì),超出了光學(xué)顯微鏡觀察極限,因此通常情況在顯微鏡下觀察不到。通過特殊的染色技術(shù),可以將染色液附加到鞭毛的周圍,增加它的直徑,從而能在光學(xué)顯微鏡下觀察到鞭毛。鞭毛染色一般分銀鹽法和復(fù)紅沉淀法兩種。

6. 莢膜染色:


       一般細(xì)菌的莢膜與染色劑的親和性低,但莢膜通透性高,因此染料可透過莢膜使菌體著色。一般采用負(fù)染色方法使背景和菌體之間形成一透明區(qū),將菌體襯托出來便于觀察分辨。

 

莢膜染色步驟:加一滴6%葡萄糖水溶液在載玻片的一端,無菌操作,挑取細(xì)菌斜面上培養(yǎng)72h左右的膠質(zhì)芽孢桿菌與其混合,加1滴墨汁充分混勻,用推片法制片將菌液鋪成薄層,自然干燥,滴加1-2滴無水乙醇覆蓋涂片,固定1min,自然干燥,在已晾干的涂面上,滴加1%結(jié)晶紫染色液染色,2min后用20%的硫酸銅沖洗數(shù)次,再用自來水沖洗一次,使用擦鏡紙擦干后即可鏡檢。有莢膜的菌菌體呈紫色,背景灰黑色,莢膜不著色呈無色透明圈。

染色法在細(xì)菌的觀察、分類、鑒定中經(jīng)常用到,因此是微生物檢測人員不-可或缺的基本技能之一。

 

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