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細胞遷移以及侵襲實驗

2015-7-31  閱讀(3862)

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  遷移實驗(cell migration assay)

 實驗材料
(1)ThinCert插入式細胞培養器: 24-well, 8.0-μm pore membranes (Greiner662638)

(2)細胞培養相關試劑:無血清培養基,10%血清培養基,PBS,0.02%EDTA

(3)固定液:甲醇

(4)染色液:Giemsa染液

(5)封片劑:中性樹膠

(6)其他:小鑷子,棉棒,載玻片,蓋玻片

 操作步驟

(1)所有細胞培養試劑和ThinCert放在37℃溫育;

(2)待測細胞培養至對數生長期,消化細胞,用PBS和無血清培養基先后洗滌一次,

 用無血清培養基懸浮細胞,計數,調整濃度  為2×105 /ml;

(3)在下室(即24孔板底部)加入600-800μl 含10%血清的培養基,上 室加入100-

 150μl細胞懸液,繼續在孵箱培養24小時;

(4)用鑷子小心取出ThinCert,吸干上室液體,移到預先加入約800μl甲醇的孔中,室溫固定30分鐘;

(5)取出ThinCert,吸干上室固定液,移到預先加入約800μl Giemsa染液 的孔中,室溫染色15-30分鐘;

(6)輕輕用清水沖洗浸泡數次,取出ThinCert,吸去上室液體,用濕棉棒小 心擦去上室底部膜表面上的細胞;

(7)用小鑷子小心揭下膜,底面朝上晾干,移至載玻片上用中性樹膠封片;

 (8)顯微鏡下取9個隨機視野計數,統計結果。

  注意事項

(1)根據待測細胞體積大小選擇合適孔徑的ThinCert。常用的為8.0-μm孔徑(如

  AGS細胞),如果細胞體積較大可以考慮用10-μm孔徑;

(2)根據待測細胞的遷移能力強弱調整細胞數和遷移時間。常規24-well  ThinCert接種細胞數約

 為2≈5×104/well, 遷移時 間 12≈36小時;

(3)由于Greiner公司的24-Transwell內含24個獨立的ThinCert,為了避免操作污染,

 每次實驗可預先另準備一塊24孔普通培養板(Greiner);

(4)如果細胞遷移能力較弱,下室液體可用3T3細胞無血清培養24小時獲得 的上清加50μg/ml FN(Fibronectin),

 具體可查  閱相關文獻;

(5)細胞懸液加入膜中央,盡量保證液面水平;

(6)固定染色擦洗時動作小心,避免擦去膜底面的細胞。但一定要充分擦凈膜 表面上未遷移的細胞,

 以免影響讀數。尤其是  膜周邊上可用細牙簽或小鑷子纏上濕棉花擦洗,但要小心避免將膜戳破;

(7)Chamber和膜上都無法標記,操作時應小心避免混淆實驗組和對照組;

(8)充分晾干,避免殘留水分導致鏡下聚焦不一致。



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