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嬰幼兒食品和乳品中反式脂肪酸的測定
閱讀：1283 發布時間：2011-7-12
嬰幼兒食品和乳品中反式脂肪酸的測定
一、原理
試樣中的脂肪用溶劑提取。提取物在堿性條件下與甲醇反應生成脂肪酸甲酯，用配有氫火焰離子化檢測器的氣相色譜儀分離順式脂肪酸甲酯和反式脂肪酸甲酯，外標法定量。
本方法依據《食品安全國家標準GB 5413.36—2010嬰幼兒食品和乳品中反式脂肪酸的測定》方法中規定。
二、試劑和材料
1. 石油醚：沸程30℃～60℃。
2 .乙醚（C4H10O）。
3 .乙醇（C2H6O）：體積分數為95%。
4 .正己烷（C6H14）：色譜純。
5 .氨水（NH3•H2O）：25%～28%。
6 .氫氧化鉀（KOH）。
7 .甲醇（CH4O）。
8 .淀粉酶：活力單位：1.5U/mg，根據活力單位大小調整用量。
9.無水硫酸鈉（Na2SO4）。
10. 氫氧化鉀-甲醇溶液（4mol/L）：稱取26.4 g 氫氧化鉀，溶于約80mL 甲醇中。冷卻至室溫，用甲醇定容至100mL，加入約5g 無水硫酸鈉，充分攪拌后過濾，保留濾液。
11. 脂肪酸甲酯標準品：十八酸甲酯（C18:0）、反-9-十八碳一烯酸甲酯（C18:1-9t）、順-9-十八碳一烯酸甲酯（C18:1-9c）、反-9，12-十八碳二烯酸甲酯（C18:2-9t，12t）、順-9，12-十八碳二烯酸甲（C18:2-9c，12c），放入冰箱在-15℃以下保存。
12. 反式脂肪酸甲酯標準貯備液：濃度分別為10.0mg/ mL。稱取500mg（到0.1 mg）反-9-十八碳一烯酸甲酯標準品和反-9，12-十八碳二烯酸甲酯標準品，分別用正己烷溶解并定容至50.0mL。放入冰箱在-15℃以下保存。
13. 反式脂肪酸甲酯標準中間液：濃度分別為1.0 mg/ mL。分別吸取兩種反式脂肪酸甲酯標準儲備液10.0 mL 入同一100 mL 容量瓶中并用正己烷（4.4）定容。臨用前配制。亦作為標準曲線zui高濃度。
14.反式脂肪酸甲酯標準工作液：臨用前配制。分別吸取反式脂肪酸甲酯標準中間液，0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL 于10mL 容量瓶中，用正己烷定容，此濃度即為0、0.2、0.4、0.6、0.8 、1.0mg/mL 的標準工作液。
15.脂肪酸甲酯標準混合液：將脂肪酸甲酯標準品，用正己烷配制成脂肪酸甲酯標準混合溶液，其中每種成分的濃度約為0.05mg/mL 至0.5mg/mL。用于進行順反脂肪酸甲酯分離程度及定性的鑒定。
16.剛果紅溶液：稱取1g 剛果紅溶解稀釋至100mL。
三、儀器和設備
1. GC-L6氣相色譜儀，帶氫火焰離子化檢測器。
2. 旋轉蒸發器。
3. 恒溫水浴：40℃～80℃。
4. 渦旋振蕩器。
5. 離心機：轉速≥4000轉/分鐘。
6. 毛氏抽脂瓶。
7. 毛氏抽脂瓶搖混器。
8. 脂肪收集瓶：圓底燒瓶，與旋轉蒸發儀配套。
9. 萬分之一電子天平：感量為0.1mg。
四、分析步驟
1.試樣處理
A. 含淀粉的試樣：稱取混合均勻的固體試樣約1.5g，液體試樣約5g（到0.1mg）于毛氏抽脂瓶中，加入約0.1g 淀粉酶（酶活力1.5U/mg），混合均勻后，加入8mL～10mL45℃±2℃的水，搖勻。蓋上瓶塞置于55℃±2℃水浴中2 h，每隔10min 搖混一次。加入兩滴約0.1 mol/L 的碘溶液，檢驗淀粉是否水解*。若無藍色出現，則水解*，否則將毛氏抽脂瓶重新置于水浴中，直至藍色消失，取出冷卻至室溫。
B. 不含淀粉的試樣：稱取混合均勻的固體試樣約1.5g，液體試樣約10g（到0.1 mg）于毛氏抽脂瓶中，加入10mL45℃±2℃的水，將試樣洗入毛氏抽脂瓶的小球中，充分混合，直到試樣*散開，冷卻至室溫。
C. 脂肪的提取：向毛氏抽脂瓶中加入3.0 mL 氨水，混勻。置于60℃±2℃水浴中15 min～20min，冷卻至室溫。加入10mL乙醇和1滴剛果紅溶液，混勻。再加入25mL乙醚，塞上軟木塞，放到毛氏抽脂瓶）搖混器上震蕩1min，也可采用手動振搖方式，再加入25mL石油醚，震蕩1 min，不低于4000轉/分鐘離心分層。傾出上清液于脂肪收集瓶中，為*次提取。在剩余試樣液中再加入5mL 乙醇，25mL乙醚，25mL石油醚按上述操作步驟進行第二次提取。用離心機離心分層后傾出上清液與*次的上清液合并。將脂肪收集瓶置于旋轉蒸發器上，在60℃±2℃通入氮氣條件下旋轉蒸發除去溶劑，保留殘渣，即為脂肪。
D. 脂肪酸甲酯的制備：將上述脂肪用正己烷溶解并定容至10.0mL，取出3.0mL 于10mL具塞試管中，加入0.3mL 氫氧化鉀-甲醇溶液。蓋緊瓶蓋，渦旋振蕩器上劇烈振搖2 min，4000轉/分鐘離心5min 后將上清液轉入氣相色譜試樣瓶中，此為試樣測定液。
2.測定
A. 參考色譜條件
色譜柱：PC2560毛細管柱（100*0.25*0.20）
進樣口溫度：250℃；載氣（Ｎ2）
檢測器溫度：300℃
分流比：10：1
進樣量：1.0μL
柱室：初溫120℃,10℃/min升至175℃，保持10min，再以5℃/min升至210℃，保持5min，5℃升至230℃，保持5min
B.標準曲線的制備
在儀器*工作條件下，對系列標準工作液分別進樣，以峰面積為縱坐標，標準工作液濃度為橫坐標繪制標準工作曲線。
C.反式脂肪酸甲酯色譜峰的鑒別
對脂肪酸甲酯標準混合溶液進樣，進行順反脂肪酸甲酯分離程度及定性的鑒定。反十八碳一烯酸甲酯和反十八碳二烯酸甲酯色譜峰的位置圖A.1
D.試樣液的測定
將試樣測定液注入氣相色譜儀，試樣測定液中反式脂肪酸甲酯峰位置圖A.1。分別測定區域C18：1t和區域C18：2t的峰面積，查標準曲線得到試樣測定液中反十八碳一烯酸甲酯和反十八碳二烯酸甲酯的質量濃度。
五、 分析結果的表述
A.試樣中反十八碳一烯酸和反十八碳二烯酸含量分別計為X1 和X2，按式（1）分別計算：
式中：
X（1或2）——試樣中反十八碳一烯酸或反十八碳二烯酸含量，單位為毫克每百克（mg/100g）；
V——試樣的定容體積，單位毫升（mL）；
m——試樣質量，單位為克（g）；
c1——試樣測定液中反十八碳一烯酸甲酯或反十八碳二烯酸甲酯的質量濃度，單位為毫克每毫升
（mg/mL）；
Mai——反十八碳一烯酸或反十八碳二烯酸的分子量；
Mbi——反十八碳一烯酸甲酯或反十八碳二烯酸甲酯的分子量。
B.試樣中反式脂肪酸的總含量 X，按式（2）計算：
式中：
X——反式脂肪酸的總含量，單位為毫克每百克（mg/100g）；
X1——試樣中反十八碳一烯酸的含量，單位為毫克每百克（mg/100g）；
X2——試樣中反十八碳二烯酸的含量，單位為毫克每百克（mg/100g）。
以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示，結果保留三位有效數字。
本標準檢出限為：反式脂肪酸總含量30 mg/kg。