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丙二醛(malondialdehyde ,MDA)含量試劑盒說明書 微量法

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丙二醛(malondialdehyde MDA)含量試劑盒說明書 微量法

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

氧自由基作用于脂質的不飽和脂肪酸,生成過氧化脂質;后者逐漸分解為一系列復雜的化 合物,其中包括MDA 。通過檢測MDA的水平即可檢測脂質氧化的水平。

測定原理:

MDA與硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid TBA)縮合,生成紅色產物,在532nm有最大吸 收峰,進行比色后可估測樣品中過氧化脂質的含量;同時測定600nm下的吸光度,利用532nm 600nm下的吸光度的差值計算 MDA  的含量。

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96  孔板、 研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配置:

提取液:液體 100mL× 1  瓶,4℃保存;

試劑一:液體 30mL× 1  瓶,4℃保存;

注意事項:

臨用前注意試劑一是否完全溶解,如未溶解,可以70℃加熱,并振蕩以促進溶解。

MDA  提取:

1 、細菌、細胞或組織樣品的制備:

細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104 ):提取液體積(mL)為500~ 10001比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液), 超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W ,超3s ,間隔10s ,重復30);8000g 4℃ 離心10min ,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)15~ 10的比例(建議稱取約0. 1g組織,加 1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min ,取上清,置冰上待測。

2 、血清(漿)樣品:直接檢測。

測定步驟:

1 、吸取0.3mL試劑一于1.5mL離心管中,再加入0. 1mL樣本,  混勻。

295℃水浴中保溫30min(蓋緊,防止水分散失),置于冰浴中冷卻,10000g25℃ 離心10min 3、吸取200μL上清液于微量石英比色皿或96孔板中,測定532nm600nm處的吸光度,記A532  A600 ΔA= A532-A600

MDA  含量計算:

a.  用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1 、血清(漿)中 MDA  含量的計算:


MDA  含量(nmol/ mL)=[ ΔA×V  反總÷(ε×d)× 109]÷V  =25.8 ×ΔA

2 、細菌、細胞或動物組織中 MDA  含量計算

1)按照蛋白濃度計算

MDA含量(nmol/mg prot)=[ ΔA×V  反總÷(ε×d)× 109]÷(Cpr×V  )=25.8 ×ΔA ÷Cpr 需要另外測定,建議使用本公司 BCA  蛋白質含量測定試劑盒。

2)按照樣品質量計算

MDA含量(nmol/g  鮮重)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)× 109]÷(W×V÷V樣總)

=25.8 ×ΔA ÷W

(3 )  按照細菌或細胞密度計算:

MDA含量(nmol/104)=[ ΔA×V  反總÷(ε×d)× 109]÷(500×V  ÷V  樣總)=0.0516×ΔA

V  反總:反應體系總體積, 4 × 10-4Lε :丙二醛摩爾消光系數,155× 103L/mol/cmd:比色 皿光徑,1cmV  樣:加入樣本體積,0. 1 mLV  樣總:加入提取液體積,1 mLCpr:樣本 蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細胞或細菌總數,500萬。

b.96  孔板測定的計算公式如下

1 、血清(漿)中 MDA  含量的計算:

MDA含量(nmol/mL)=[ΔA×V  反總÷(ε×d)× 109]÷V  =51.6 ×ΔA

2 、細菌、細胞或動物組織中 MDA  含量計算

1)按照蛋白濃度計算

MDA含量(nmol/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)× 109]÷(Cpr×V  )=51.6 ×ΔA÷Cpr 需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒。

2)按照樣品質量計算

MDA含量(nmol/g  鮮重)=[ΔA×V  反總÷(ε×d)× 109]÷(W×V÷V樣總)=51.6 ×ΔA÷W (3 )  按照細菌或細胞密度計算:

MDA含量(nmol/104)=[ ΔA×V  反總÷(ε×d)× 109]÷(500×V  ÷V  樣總)=0.1032×ΔA

V  反總:反應體系總體積,4 × 10-4Lε :丙二醛摩爾消光系數,155× 103L/mol/cmd96孔板 光徑,0.5cmV  樣:加入樣本體積,0. 1 mLV  樣總:加入提取液體積,1 mLCpr:樣本 蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細胞或細菌總數,500  萬。

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