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土壤堿性磷酸酶(S-AKP/ALP)活性測定試劑盒說明書

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土壤堿性磷酸酶(S-AKP/ALP)活性測定試劑盒說明書

微量法

測定意義:                           

土壤磷酸酶是一類催化土壤有機磷化合物礦化的酶,其活性的高低直接影響著土壤中有機磷的分解轉化及其生物有效性,是評價土壤磷素生物轉化方向與強度的指標。土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH顯著影響。通常按照其適pH范圍,分為堿性、中性和酸性三種類型磷酸酶。

測定原理:

堿性環境中,S-AKP/ALP催化磷酸苯二鈉水解生成苯酚和磷酸氫二鈉,通過測定酚的生成量即可計算出S-AKP/ALP活性。

自備儀器和用品:

紫外分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、臺式離心機、37℃恒溫培養箱、分析天平、可調式移液器、冰、蒸餾水、無水乙醇和甲苯。

試劑組成和配制:

試劑一:液體×1瓶,4℃避光保存。

試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。用前加100mL蒸餾水充分溶解。

試劑三:液體×1瓶,4℃保存。

試劑四:粉劑×1瓶,4℃避光保存。臨用前加576μL無水乙醇(自備),24μL蒸餾水充分溶解。(變褐色后不能再使用)

標準品:液體×1瓶,0.5μmol/mL苯酚標準液,4℃保存。

催化反應:

稱取風干混勻土壤約0.1g,加入0.05mL甲苯(自備),輕搖15min;加0.4 mL試劑一并且搖勻后,置于37℃恒溫培養箱,開始計時,催化反應24h;到時后迅速加入1mL試劑二充分混勻,以終止酶催化的反應。10000rpm室溫離心10min,取上清液置于冰上待測。

顯色反應:

1. 分光光度計預熱30min以上,調節波長到660nm,蒸餾水調零。

2. 空白管:取微量玻璃比色皿/酶標板,加入10μL蒸餾水,20μL試劑三,4μL試劑四,充分混勻,顯色后再加蒸餾水166μL,混勻后室溫靜置30 min,于660 nm測定吸光度,記為A空白管。

3. 標準管:微量玻璃比色皿/酶標板,加入10μL標準液,20μL試劑三,4μL試劑四,充分混勻,顯色后再加蒸餾水166μL,混勻后室溫靜置30 min,于660 nm測定吸光度,記為A標準管。

4. 測定管:微量玻璃比色皿/酶標板,加入10μL上清液,20μL試劑三,4μL試劑四,充分混勻,顯色后再加蒸餾水166μL,混勻后室溫靜置30 min,于660 nm測定吸光度,記為A測定管。

 

 

 

S-ALP活性計算:

活性單位定義:37℃中每克土壤每天釋放1μmol酚。

S-AKP/ALP(U/g土樣)=[C標準液×(A測定-A空白)÷(A標準-A空白)]×V總÷W÷T

                        = 0.725×(A測定-A空白)÷(A標準-A空白)÷W

C標準液:0.5μmol/L;V總:催化體系總體積,1.45mL;W:土壤樣品質量,g;T:催化反應時間,24 h=1 d。

 

 

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