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幾種 HRP 常見底物及其操作

時間:2025/5/9閱讀:46
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幾種 HRP 常見底物及其操作

底物范圍較廣,包括二氨基聯苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。

二氨基聯苯胺/金屬鹽
DAB是辣根過氧化物酶最敏感、常用的底物。它產生強烈的棕色產物,在水和醇中不溶解。多數情況下,推薦在DAB中加入不同的金屬離子。當加入金屬鹽如鈷、鎳至底物液中,辣根過氧化物酶可以更加敏感。此類反應產物呈暗藍灰色至黑色,且在水及醇中穩定。DAB/金屬鹽染色應用的組織染色范圍較廣。

   1.需要的溶液和特殊設備
   DAB,0.05mol/LTris緩沖液(pH7.6);
   0.3%(W/V)氯化鎳/水貯存液;
   30%過氧化氫;
   DPX。
   光學顯微鏡(通常帶有照相機以便于記錄結果)
   2.操作步驟
   (1)用9ml 0.05mol/L Tris緩沖液(pH7.6)溶解6mgDAB;
   (2)加lml 0.3%(W/V)氯化鎳/水貯存液(也可以用等量的氯化鈷替代);
   (3)加0.1 m1 3%過氧化氫。過氧化氫一般以30%的溶液提供,貯存在4E,此條件可以持續1個月;
   (4)如果出現沉淀,用濾紙過濾;
   (5)加此溶液至標本,并孵育1—20min水洗終止反應;
   (6)優化:如果需要可復染;
   (7)用DPX封片。

氯萘酚
   氯萘酚可以形成一種藍黑色產物。敏感性低于DAB,且產物可溶于醇中。它適用于當DAB反應形成較高背景或要求改變產物的顏色。

   1.需要的溶液和特殊設備
   0,03%氯萘酚,用無水乙醇溶解(貯存在-20℃),0.05mol/LTris(pH7.6)
   過氧化氫;
   Gelvatol或者Mowiol。
   光學顯微鏡(通常帶有照相機以便于記錄結果)。

   2.操作步驟
   (1)氯萘酚貯存液的準備:用10ml無水乙醇溶解0.3g氯萘酚,貯存于—20℃;
   (2)加100ul氯萘酚貯存液至10ml 0.05mol/LTris(pH7.6),
   (3)加0.1ml 3%過氧化氫于水中。過氧化氫一般是以30%的溶液提供,4℃可存放1個月;
   (4)白色沉淀可用濾紙過濾去除;
   (5)加此溶液到標本中,并在室溫孵育10~40min,水洗終止反應;
   (6)優化:如果需要,進行復染,但只可使用水溶性染料;
   (7)用Gelvatol或者Mowiol封片。

氨乙基咔唑
   氨乙基咔唑(AEC)產生紅色產物,其敏感性低于DAB,但可用于DAB反應產生較高背景或要求改變產物顏色的試驗。此產物可溶于醇,但不溶于水。

   1.需要的溶液和特殊設備
   0.4%AEC用N,N—二甲基甲酰胺(DMF)溶解;
   0.1mol/L乙酸鈉緩沖液(pH5.2);
   過氧化氫;
   Gelvatol或Mowi01.
   光學顯微鏡(通常帶有照相機以便于記錄結果)。

   2.操作步驟
   (1)用lmlDMF溶解4mgAEC。AEC在DMF中穩定,因此,可以用100mlDMF溶解0.4gAEC作為貯存液備用;
   (2)加lmlAEC溶液至15ml 0.1mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH5.2)中,并攪拌;
   (3)加0.15ml 3%過氧化氫于水中。過氧化氫一般是30%的溶液提供,在4℃可存放1個月;
   (4)用濾紙過濾;
   (5)加此溶液到標本中,并于室溫孵育10~40min,水洗終止反應;
   (6)優化:如果需要復染,只可用水溶性染料;
   (7)用Gelvatol或Mowiol封片。

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