摘要

分析儀器對于評估產品質量和生物藥產品開發過程控制至關重要，它在制藥行業中應用于各種應用，如與產品質量相關的研究，如單克隆抗體中的糖基分析和細胞培養基中氨基酸和代謝物濃度。盡管液相質譜（LC-MS）具有靈活應用解決復雜問題的能力，但其實驗開發通常比其他分析方法耗時更多。最近，如908 Devices的REBEL等新型分析設備采用了操作簡化用戶友好的方法，以替代傳統勞動密集型LC-MS。REBEL是一種能夠快速定量氨基酸和其他重要代謝物，實現全面分析和高通量樣本測試的儀器，而我們的目的是比較這一代分析平臺（908 Devices的REBEL）與經典LC-ToF MS方法，并評估數據質量。

引言

生物制藥公司越來越關注培養基成分的理解和產品的質量，為了提高生產效率，他們必須面對的是耗時的傳統方法。細胞系開發和優化是過程策略的重要組成部分。傳統上，使用液相質譜（LC-MS）進行培養基營養和代謝組學研究，這需要高度的技術專長，且耗時較長。然而，優化實驗需要對生物反應器參數的實時監測、過程分析和產品質量屬性的結果來支持。908 Devices的全自動培養基組分分析儀系統，即REBEL，作為一種新型分析儀器，因其快速分析和簡單操作而受到生物制藥行業的廣泛關注。

本文介紹REBEL替代傳統LC-MS方法，在生物反應器培養基監測方面的最新進展。REBEL進行培養基分析的主要優勢包括無需衍生化即可分析、快速的分析時間和簡單的操作。然而，由于該儀器是市場新秀，其分析技術描述尚不充分。因此，我們采用Waters的非衍生化和正相色譜方法，使用BioAccord RDa飛行時間（ToF）LC-MS進行培養基分析的比較。我們的目標是展示REBEL和RDa培養基分析結果的可比性，并探討兩種分析儀器方法的成本效益。此外，我們將在實驗室中建立這兩種分析方法，以便在未來代謝研究中評估過程變化、補料策略及其對產品質量的影響，從而深化我們對關鍵過程參數及其對藥物產品質量特性影響的理解。

結果與討論

圖1. 生物反應器1（頂部）和2（底部）的68到227小時的氨基酸濃度趨勢，pH 設定在7.1。樣品由Waters BioAccord RDa LC-MS（藍色）和REBEL培養基分析儀（紅色）進行分析。

圖2. 生物反應器3（頂部）和4（底部）的68到227小時的氨基酸濃度趨勢，pH設定在 7.3。樣品由Waters BioAccord RDa LC-MS（藍色）和REBEL培養基分析儀（紅色）進行分析。

表1：REBEL和LC-MS之間的比較，其中+代表所需的技術專業知識或需要的數量。

我們能夠成功地使用REBEL和BioAccord RDa LC-MS上的初步方法運行所有樣品，從而在UNIFI上創建一種處理方法，以在我們的RDa LC-質譜分析中從標準校準曲線中識別、質量確認和量化所有氨基酸。Rebel導出了所有氨基酸的計算濃度，并創建了手動數據透視表來說明左側顯示的結果。生物反應器復制品1和2在pH 7.1設定值下運行，并在整個培養物中顯示出相似的氨基酸趨勢（圖1）。類似地，生物反應器復制品3和4在pH 7.3設定值下運行時相互共享趨勢（圖2）。生物反應器1-4的氨基酸趨勢以藍色表示用于BioAccord RDa LC-MS分析，以紅色表示用于REBEL分析。REBEL和RDa LC-MS數據顯示所有反應器的氨基酸趨勢相當。對于樣品制備，與RDa LC-MS的1:500相比，REBEL方法的樣品稀釋比例為1:100，這表明RDa LC-MS的靈敏度至少是REBEL的五倍。然而，我們可以看到，RDa LC-MS中204和227小時氨基酸濃度的較晚時間點遠高于REBEL。這很可能是因為這些值是在標準曲線之外發現的，因此，外推濃度會導致計算誤差。REBEL只能分析33種分析物，包括22種氨基酸、5種維生素和6種生物胺，其中RDa是Tof LC-MS，可以分析這些和其他未知的分析物。表1列出了REBEL與傳統LC-MS的比較，其中REBEL易于使用，不需要太多時間或精力來操作，但犧牲了在其范圍之外進行分析的能力，并且相比于TOF質譜靈敏度略低。傳統的LC-MS方法可以以更好的靈敏度進行專門優化，但這需要更高水平的技術技能。REBEL為自動化分析提供了包羅萬象的試劑盒，但每個樣本的試劑盒分析成本遠高于LC-MS方法所需的材料。總體而言，REBEL在其分析范圍內以更高的運行成本/表現相對較好，但其易用性和快速分析是推進實時過程優化的主要優勢。

材料與方法

我們從Sartorius的AMBR250生物反應器（VRC01 CHO細胞培養）中采集每日樣本，進行了一次10天的批次實驗。重復的生物反應器1和2的pH為7.1，生物反應器3和4的pH為7.3，其余保持一致。樣本經過處理和過濾，用于分析細胞培養基反應液的游離氨基酸濃度。

REBEL的培養基分析試劑盒（908 Devices）提供了BGE溶液和稀釋液，還有預制好的標準品。樣品用稀釋液稀釋100倍。所有的濃度數據以.csv文件形式輸出。而BioAccord RDa（Waters）的LC-MS方法是基于Waters的應用指南調整的，以適應Accuilty Patrols作為LC系統的特定設置。氨基酸細胞培養標準品（Waters）根據說明書新鮮制備，每個氨基酸的6點校準曲線為5uM-0.5uM，除了2.5uM-0.25uM的胱氨酸。新鮮制備樣品，并用0.1%甲酸以1:500稀釋。用UNIFI（Waters）處理獲得的LC-MS數據，以創建標準曲線，識別和量化氨基酸濃度。所有樣品（REBEL和BioAccord RDa）均進行三次重復。

結論

我們的初步RDa LC-MS方法表明，REBEL細胞培養基分析儀收集的數據與CHO細胞培養生物反應器具有可比性。目前，基于REBEL的實驗結果，我們正在優化RDa LC-MS方法，使用8點校準曲線（范圍0.1-30uM），以捕捉所有氨基酸濃度。一旦使用最終確定的RDa LC-MS方法對所有樣本進行分析，將進行進一步的方法比較和統計分析。我們將評估零假設的方法，即用REBEL進行的測量與用RDa LC-MS進行的測量不同，然后尋找基于數據的證據，證明測量是相同的。如果數據支持否定零假設，那么我們可以得出結論，這些儀器在每次比較的代謝物測量中都具有同等的性能。未來的研究將進一步測試REBEL評估代謝對產品質量影響的能力，例如溫度變化對代謝產物利用的影響及其對微生物反應器中聚糖譜的影響。由于細胞代謝可以在代謝產物的利用和濃度方面產生共線性，我們將使用多變量數據分析（MVDA）來評估細胞代謝及其對聚糖譜的影響。REBEL的易用性和快速分析的優勢允許更大的樣本通量，同時保留與傳統LC-MS方法相似的數據質量，以快速推進我們對關鍵質量屬性的影響的理解，從而提高關鍵工藝參數的理解。