YIJI細菌堿性磷酸酶活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

YIJI細菌堿性磷酸酶活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過底物對硝基苯磷酸受到堿性磷酸酶的水解，產生有色產物，在分光光度儀下，其吸光峰值的變化，即采用比色法定量測定細菌樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細菌菌株（野生或培養）裂解樣品堿性磷酸酶的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，活體檢測，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

堿性磷酸酶（Alkaline Phophatase；ALP；EC3.1.3.1）存在于許多細菌細胞中的外周膜結合性酶，為同源二聚體金屬性酶蛋白。一旦細菌的磷濃度過低，則誘導堿性磷酸酶的活性，其功能在于參與細菌磷代謝。在分子生物學和免疫學實驗和診斷運用中，堿性磷酸酶成為一種重要的工具。堿性磷酸酶在堿性條件下水解單磷酸。基于底物對硝基苯磷酸（p-nitrophenyl phosphate；PNPP），在堿性磷酸酶的催化水解下，釋放出對硝基苯酚（p-nitrophenol）和磷酸（phosphate），通過分光光度儀檢測對硝基苯酚（410nm），來定量測定堿性磷酸酶的活性。堿性磷酸酶反應系統為：

Alkaline Phophatase

p-nitrophenyl phosphate  +  H2O    →   p-nitrophenol  +  inorganic phosphate

產品內容

YIJI裂解液（Reagent A）    10毫升

YIJI活性液（Reagent B） 250微升

YIJI緩沖液（Reagent C）  20毫升

YIJI反應液（Reagent D）   2毫升

產品說明書      1份

保存方式

保存YIJI活性液（Reagent B）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；YIJI反應液（Reagent D）避免光照；有效保證3月；一旦打開使用，有效保證1至2月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品制備

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

實驗步驟

一、 樣品準備

1． 準備好10毫升待測的細菌 

2． 轉移到15毫升錐形離心管

3． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為7000g

4． 小心抽去上清液

5． 加入500微升YIJI裂解液（Reagent A），充分混勻

6． 轉移到預冷的1.5毫升離心管

7． 加入12.5微升YIJI活性液（Reagent B）

8． 強力渦旋震蕩15秒

9． 置于冰槽里15分鐘

10． 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

11． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

12． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－YIJI30030.1）

13． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、 測讀準備

1．開啟分光光度儀預熱

2．設定好分光光度儀：溫度37℃，波長410nm，間隔60秒，測讀6次（共5分鐘），并置零

3．YIJI緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、背景對照測定

1． 移取880微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入100微升YIJI反應液（Reagent D）

3． 在37℃溫度下孵育3分鐘

4． 加入20微升YIJI清理液（Reagent A） 

5． 上下傾倒數次，混勻（5秒鐘內）

6． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（5分鐘讀數－0分鐘讀數）

四、樣品測定

1． 移取880微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入100微升YIJI反應液（Reagent D）

3． 在37℃溫度下孵育3分鐘

4． 加入20微升待測樣品（注意：建議總量20微克細胞總蛋白）

5． 即刻上下傾倒數次，混勻（5秒鐘內）

6． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（5分鐘讀數－0分鐘讀數）   

五、 計算樣品活性

【（樣品讀數－背景讀數）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數】÷【0.02（樣品容量；毫升）X 15.46（毫摩爾吸光系數）X 5（反應時間；分鐘）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾對硝基苯磷酸/分鐘

六、 酶標儀測定

1． 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品

2． 分別移取220微升YIJI緩沖液（Reagent C）到所有孔里

3． 分別加入25微升YIJI反應液（Reagent D）到所有孔里

4． 在37℃溫度下孵育3分鐘

5． 分別加入5微升YIJI清理液（Reagent A）或待測樣品（10微克細胞總蛋白）到相應孔里（注意：樣品須清澈）

6． 輕輕搖動96孔板

7． 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和5分鐘讀數

8． 活性計算

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 15.46（毫摩爾吸光系數）X 0.6（光徑距離；厘米）X 5（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克 

單位＝微摩爾對硝基苯磷酸/分鐘

注意事項

1． 本產品為20次（比色皿）或80次（96孔板）操作，包括背景對照

2． 操作時，須戴手套

3． 樣品避免使用磷酸鹽緩沖溶液和EDTA等處理

4． 系統操作過程中，背景測定只需1次

5． 加入樣品后5秒內進行比色測定

6． 比色測定后，比色皿須清洗*

7． 樣本測定吸光讀數升高表明具有酶活性

8． 樣品測定可以持續5分鐘；計算活性時，可以選擇其中單位時間（1分鐘）的線性zui大吸光讀數差值作為樣本讀數

9． 堿性磷酸酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 8.0的情況下，每單位酶在單位時間內（每分鐘）水解1微摩爾對硝基苯磷酸

10． 建議待測樣本總蛋白濃度為10至20微克/20微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供YIJI Bradford蛋白質濃度定量試劑盒YIJI30030.1）

11． 本公司提供系列磷酸化酶學檢測試劑產品

單組份訂購信息

編號 名稱 規格

YIJI50050.4 YIJI細菌堿性磷酸酶活性比色法定量檢測試劑盒 20次

YIJI50050.4A YIJI裂解

YIJI細菌堿性磷酸酶活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

YIJI細菌堿性磷酸酶活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過底物對硝基苯磷酸受到堿性磷酸酶的水解，產生有色產物，在分光光度儀下，其吸光峰值的變化，即采用比色法定量測定細菌樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細菌菌株（野生或培養）裂解樣品堿性磷酸酶的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，活體檢測，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

堿性磷酸酶（Alkaline Phophatase；ALP；EC3.1.3.1）存在于許多細菌細胞中的外周膜結合性酶，為同源二聚體金屬性酶蛋白。一旦細菌的磷濃度過低，則誘導堿性磷酸酶的活性，其功能在于參與細菌磷代謝。在分子生物學和免疫學實驗和診斷運用中，堿性磷酸酶成為一種重要的工具。堿性磷酸酶在堿性條件下水解單磷酸。基于底物對硝基苯磷酸（p-nitrophenyl phosphate；PNPP），在堿性磷酸酶的催化水解下，釋放出對硝基苯酚（p-nitrophenol）和磷酸（phosphate），通過分光光度儀檢測對硝基苯酚（410nm），來定量測定堿性磷酸酶的活性。堿性磷酸酶反應系統為：

Alkaline Phophatase

p-nitrophenyl phosphate  +  H2O    →   p-nitrophenol  +  inorganic phosphate

產品內容

YIJI裂解液（Reagent A）    10毫升

YIJI活性液（Reagent B） 250微升

YIJI緩沖液（Reagent C）  20毫升

YIJI反應液（Reagent D）   2毫升

產品說明書      1份

保存方式

保存YIJI活性液（Reagent B）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；YIJI反應液（Reagent D）避免光照；有效保證3月；一旦打開使用，有效保證1至2月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品制備

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

實驗步驟

• 樣品準備

• 準備好10毫升待測的細菌 
• 轉移到15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為7000g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升YIJI裂解液（Reagent A），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 加入12.5微升YIJI活性液（Reagent B）
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里15分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－YIJI30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

• 測讀準備

1．開啟分光光度儀預熱

2．設定好分光光度儀：溫度37℃，波長410nm，間隔60秒，測讀6次（共5分鐘），并置零

3．YIJI緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、背景對照測定

• 移取880微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升YIJI反應液（Reagent D）
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升YIJI清理液（Reagent A） 
• 上下傾倒數次，混勻（5秒鐘內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（5分鐘讀數－0分鐘讀數）

四、樣品測定

• 移取880微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升YIJI反應液（Reagent D）
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升待測樣品（注意：建議總量20微克細胞總蛋白）
• 即刻上下傾倒數次，混勻（5秒鐘內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（5分鐘讀數－0分鐘讀數）   

• 計算樣品活性

【（樣品讀數－背景讀數）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數】÷【0.02（樣品容量；毫升）X 15.46（毫摩爾吸光系數）X 5（反應時間；分鐘）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾對硝基苯磷酸/分鐘

• 酶標儀測定

• 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取220微升YIJI緩沖液（Reagent C）到所有孔里
• 分別加入25微升YIJI反應液（Reagent D）到所有孔里
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入5微升YIJI清理液（Reagent A）或待測樣品（10微克細胞總蛋白）到相應孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和5分鐘讀數
• 活性計算

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 15.46（毫摩爾吸光系數）X 0.6（光徑距離；厘米）X 5（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克 

單位＝微摩爾對硝基苯磷酸/分鐘

注意事項

• 本產品為20次（比色皿）或80次（96孔板）操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 樣品避免使用磷酸鹽緩沖溶液和EDTA等處理
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 加入樣品后5秒內進行比色測定
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 樣本測定吸光讀數升高表明具有酶活性
• 樣品測定可以持續5分鐘；計算活性時，可以選擇其中單位時間（1分鐘）的線性zui大吸光讀數差值作為樣本讀數
• 堿性磷酸酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 8.0的情況下，每單位酶在單位時間內（每分鐘）水解1微摩爾對硝基苯磷酸
• 建議待測樣本總蛋白濃度為10至20微克/20微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供YIJI Bradford蛋白質濃度定量試劑盒YIJI30030.1）
• 本公司提供系列磷酸化酶學檢測試劑產品

單組份訂購信息

編號 名稱 規格

YIJI50050.4 YIJI細菌堿性磷酸酶活性比色法定量檢測試劑盒 20次

YIJI50050.4A YIJI裂解液（Reagent A）     50毫升

YIJI50050.4B YIJI活性液（Reagent B）      1毫升

YIJI50050.4C YIJI緩沖液（Reagent C）     100毫升

YIJI50050.4D YIJI反應液（Reagent D）      50毫升

YIJI30030.1 YIJI Bradford蛋白質濃度定量試劑盒 100次

液（Reagent A）     50毫升

YIJI50050.4B YIJI活性液（Reagent B）      1毫升

YIJI50050.4C YIJI緩沖液（Reagent C）     100毫升

YIJI50050.4D YIJI反應液（Reagent D）      50毫升

YIJI30030.1 YIJI Bradford蛋白質濃度定量試劑盒 100次