聯(lián)系電話
上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司
中級會員·16年
- 聯(lián)系人：
- 楊經(jīng)理
- 電話：
- 021-50724187 021-50724961
- 手機(jī)：
- 15921799099
- 傳真：
- 021-50724961
- 地址：
- 上海浦東川沙鎮(zhèn)川沙路6619號上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司
- 個(gè)性化：
- www.qfbio.com
- 網(wǎng)址：
- www.qfbio.com
掃一掃訪問手機(jī)商鋪
mdbioproducts常見實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用程序的故障排除
一般實(shí)驗(yàn)室技術(shù)
洗滌技巧：
多通道移液器或噴瓶
確保移液器的每個(gè)尖頭都正確分配或噴射瓶有足夠的壓力。清空孔中的內(nèi)容物并用指示的洗滌緩沖液體積填充孔。倒出孔，倒置并在干凈的紙巾上吸干。如插入所示重復(fù)此過程。最后一次傾析后，倒置去除任何剩余的洗滌緩沖液，并將其吸干在干凈的紙巾上。不要讓孔靜置，按照插圖中的指示進(jìn)行下一步。注意：如果在傾析時(shí)條帶變得松散，則在清洗和在干凈的水槽中潷析之前對條帶進(jìn)行編號非常有用。
歧管分配器或自動清洗機(jī)
確保有適當(dāng)?shù)恼婵展?yīng)。檢查所有插管或插腳是否正確分配和抽吸。通過抽吸或傾析清空孔。將每個(gè)孔填充到插入物中指示的適當(dāng)體積。*吸出孔。去除緩沖液后，讓抽吸裝置留在孔中，不要過度抽吸孔。如插入物所示重復(fù)此過程，不要讓孔在最后一次抽吸后保持干燥。
移液技術(shù)：
確保您使用的移液器已校準(zhǔn)，并且移液器吸頭正確且牢固地固定在移液器上。將移液器設(shè)置到所需的體積并用樣品或試劑預(yù)沖洗。緩慢向上吸取試劑，使移液器緩慢返回向上位置。稍等片刻，讓試劑在吸頭中達(dá)到體積平衡。將試劑緩慢分配到第一次停止，然后輕輕分配到第二次停止。將移液器保持在此位置，直到將其從儲液器或孔中取出，以避免將試劑吸回。當(dāng)您取下移液器時(shí)，將吸頭向上拉到容器或孔的一側(cè)，以釋放可能在吸頭外側(cè)的任何液體。
ELISA 故障排除
許多因素會影響 ELISA 的性能。
- 在開始之前仔細(xì)閱讀說明。這將有助于避免不必要的錯(cuò)誤。
- 使用良好的實(shí)驗(yàn)室規(guī)范和校準(zhǔn)設(shè)備。
- 使用干凈的容器和干凈的實(shí)驗(yàn)室空間，并在每種試劑之間更換移液器吸頭。
- 重復(fù)運(yùn)行所有標(biāo)準(zhǔn)和樣品，因?yàn)檫@將提高準(zhǔn)確性。
精度差：
- 清洗不*：確保儀器工作正常，并且抽吸后孔看起來是干的。
- 試劑混合不均：確保試劑充分混合。
- 污染：確保使用干凈的容器并在每種試劑之間更換移液器吸頭。
- 移液錯(cuò)誤：使用良好的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)并確保正確校準(zhǔn)移液器。
標(biāo)準(zhǔn)曲線：
- 標(biāo)準(zhǔn)品制備不當(dāng)：確保正確配制標(biāo)準(zhǔn)品并遵守稀釋說明。
- 清洗不*：確保儀器工作正常，并且抽吸后孔看起來是干的。
- 添加到孔中的體積不等：檢查移液器是否已校準(zhǔn)以及移液器吸頭是否正確就位。
- 確保從凈 OD 中減去空白和 NSB 值。
高背景：
- 確保正確洗滌板。回顧上面的洗滌技術(shù)。
- 遵守所有孵化時(shí)間和溫度。高背景可能是由于孵育時(shí)間過長或在高于推薦溫度的情況下孵育造成的。
漂移
- 使用前將所有試劑置于室溫。
- 在運(yùn)行檢測之前或按照試劑盒說明書中的指示準(zhǔn)備試劑。
- 避免中斷檢測設(shè)置。
邊緣效果
- 在環(huán)境條件下孵育板時(shí)，請注意溫度變化或通風(fēng)區(qū)域。將印版放在空調(diào)或暖氣通風(fēng)口下可能會導(dǎo)致顏色不均勻。
色彩發(fā)展
- 確保所有試劑以正確的體積和正確的時(shí)間添加到檢測中。堅(jiān)持正確的孵化時(shí)間。
- 除非試劑盒插頁中另有說明，否則在加入終止溶液后立即讀取板。
- 底物是否正確準(zhǔn)備和添加
數(shù)據(jù)縮減
- 如需有關(guān)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的幫助，
IHC 故障排除
無染色
| 問題 | 可能的解決方案） | |
| 一抗和二抗可能不匹配。 | 建議二抗針對產(chǎn)生一抗的物種（例如，如果一抗是在小鼠中產(chǎn)生的，則使用抗小鼠二抗）。 | |
| 該抗體可能不適用于以天然（非變性）形式顯示蛋白質(zhì)的 IHC 程序。 | 在非變性和變性蛋白質(zhì)印跡上測試抗體，以確保抗體識別非變性抗原。 | |
| 二抗未避光保存。 | 建議避免將二抗暴露在光線下。 | |
| 沒有足夠的一抗與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合。 | 減少抗體稀釋。 在 4°C 下孵育更長時(shí)間。 | |
| 感興趣的蛋白質(zhì)并不大量存在于組織中。 | 運(yùn)行陽性對照。 利用放大步驟可以幫助放大信號。 使用較低稀釋度的一抗。 | |
| 目標(biāo)蛋白是核蛋白，抗體不能穿透細(xì)胞核。 | 為了促進(jìn)細(xì)胞核的滲透，在封閉緩沖液和抗體稀釋緩沖液中加入透化劑。 | |
| 脫蠟可能不夠 | 將切片脫蠟時(shí)間更長。 使用新鮮制備的二甲苯。 | |
| 福爾馬林和多聚甲醛等固定劑可能會改變抗體識別的表位。 | 使用抗原修復(fù)方法揭露表位。 修復(fù)時(shí)間更短。 | |
| PBS 緩沖液可能被細(xì)菌污染，這些細(xì)菌已經(jīng)破壞了目標(biāo)蛋白質(zhì)。 | 在 PBS 抗體儲存緩沖液中使用防腐劑，如 0.01% 疊氮化物。 使用新鮮的無菌 PBS。 |
高背景
| 問題 | 可能的解決方案） | |
| 非特異性結(jié)合的阻斷可能是不夠的。 | 將切片的封閉潛伏期延長至 30 分鐘，將細(xì)胞培養(yǎng)延長至 1 小時(shí)。使用封閉劑，例如 10% 正常血清用于切片，1-5% BSA 用于細(xì)胞培養(yǎng)。 | |
| 一抗?jié)舛瓤赡芴摺?/td> | 將抗體滴定至更佳濃度，使用更多稀釋液孵育更長時(shí)間。這將提供更慢但更具體的綁定。 | |
| 二抗可能非特異性結(jié)合。 | 在沒有一抗的情況下運(yùn)行二級對照。 | |
| 孵化溫度可能太高。 | 在 4°C 下孵育組織切片或細(xì)胞。 | |
| 組織未充分洗滌。 | 在所有步驟之間用 PBS *清洗 | |
| 內(nèi)源性過氧化物酶是有活性的。 | 使用酶抑制劑，如堿性磷酸酶的左旋咪唑 (2 mM) 或過氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。 | |
| 福爾馬林和多聚甲醛等固定劑太強(qiáng)，可能已經(jīng)改變了抗體識別的表位。 | 改變抗原修復(fù)方法。 減少抗原暴露溶液的孵育時(shí)間。 | |
| 應(yīng)用了過多的基材。 | 減少底物孵育時(shí)間。 | |
| 色原與細(xì)胞中存在的 PBS 發(fā)生反應(yīng)。 | 在與底物一起孵育之前，使用 Tris 緩沖液清洗切片。 | |
| 透化已經(jīng)損壞了膜并去除了膜蛋白。 | 從緩沖液中去除通透劑。 |
非特異性染色
| 問題 | 可能的解決方案） | |
| 一抗或二抗的濃度可能太高。嘗試降低抗體濃度和/或潛伏期。 | 將信號強(qiáng)度與不表達(dá)目標(biāo)的細(xì)胞進(jìn)行比較。 | |
| 一抗是針對與染色組織相同的物種產(chǎn)生的（例如在大鼠組織上測試的大鼠一抗）。 | 當(dāng)應(yīng)用二抗時(shí)，它會與所有組織結(jié)合，因?yàn)樗彩轻槍υ撐锓N產(chǎn)生的。使用針對與您的組織不同的物種產(chǎn)生的一抗/二抗。 | |
| 內(nèi)源性過氧化物酶是有活性的。 | 使用酶抑制劑，如堿性磷酸酶的左旋咪唑 (2 mM) 或過氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。 | |
| 切片/細(xì)胞已變干。 | 將組織切片和細(xì)胞保持在高濕度下，不要讓它們變干。 |
