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上海起發實驗試劑有限公司
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proaxsis ProteaseTag ® 主動彈性蛋白酶免疫操作指南
ProteaseTag® Active Neutrophil Elastase Immunoassay
免疫測定分為兩個部分：
1）一個較大的盒子[58 cm x 38 cm x 35 cm; 體重±10公斤（體重主要是由于凝膠袋）]，其包含需要保持在4℃冷卻并且必須投入在接收到冰箱的液體瓶，
和
2）一個小的內“冷凍箱” [39厘米× 27厘米x 28厘米; 重量±7公斤（重量主要歸因于干冰）]，我們在干冰上單獨發送。
因此，每個套件將[快遞]分2個單獨的包裹寄送，總重為±17公斤。
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試劑盒內容物
冷凍箱組件 |
|
NE標記 | 1小瓶含4µl（濃度10 mM）捕獲探針 N,N-二甲基甲酰胺(DMF) |
人中性粒細胞彈性蛋白酶標準品 | 2瓶含6µl天然NE（濃度100µg/ml）的酸性緩沖液 |
NE結合物 | 1瓶含25µl 穩定性溶液中與辣根過氧化物酶(HRP)結合的抗人中性粒細胞彈性蛋白酶抗體 |
主要試劑盒組分 |
|
免疫分析板 | 96孔鏈霉親和素包被微量滴定板（預封閉） |
NE清洗緩沖液A濃縮液 | 24 mL 25倍濃度的緩沖表面活性劑（含防腐劑） |
NE洗滌緩沖液B濃縮液 | 8 mL含防腐劑的25倍濃度緩沖液 |
NE標準品稀釋劑 | 15 mL含防腐劑的緩沖液（即用型） |
NE試劑稀釋劑 | 2 x 13 mL含防腐劑的緩沖表面活性劑（即用型） |
TMB底物 | 12 mL四甲基聯苯胺（即用型） |
終止液 | 6 mL 2N硫酸（即用型） |
封板機 | 4個粘合條 |
需要但未提供的材料
- 去離子水或蒸餾水
- 經校準的移液器和相應的移液器吸頭
- 試管和試管架
- 清潔稀釋清洗緩沖液的容器
- 渦旋
- 培養箱(37 ℃)
- 能夠在450 nm處讀數的經校準的微量滴定板讀數器
試劑制備
除標準品和樣品外，所有試劑均應在使用前恢復至室溫。使用前，標準品和樣品必須始終置于冰上。
提供了足夠的試劑，可獲得兩條標準曲線。
_清洗緩沖液A-用576 mL去離子水稀釋24 mL濃縮液，制成600 mL清洗緩沖液A
_清洗緩沖液B–量取8 mL濃縮液，加入192 mL去離子水中，制成200 mL清洗緩沖液B
_NE結合物–用11980µl NE試劑稀釋劑稀釋20µl NE結合物，制備12 mL結合物溶液（600倍稀釋）
_NE-Tag–用11997.6µl NE試劑稀釋劑稀釋2.4µl NE-Tag，制備12 mL NE-Tag溶液（5000倍稀釋）
_標準品-
- 移取495µl NE標準品稀釋液至一個微量管中
- 移取250µl NE標準品稀釋液至6個后續微量管中
- 向試管中加入5µl NE標準品。從一個試管移取250µl至下一個試管，進行連續稀釋。轉移至下一試管前，充分混勻各試管。這將創建具有以下NE濃度的校準曲線：1000、500、250、125、62.5、31.25和15.625 ng/mL
- 使用NE標準品稀釋劑作為零（空白）標準品
_樣品-使用NE標準品稀釋劑適當稀釋。
試驗程序
所有樣品和標準品均應重復測定兩次。
- 按照上文所述制備所有試劑、標準品和樣品。建議在加至微孔板之前立即制備標準品和樣品
- 從鋁箔袋中取出平板
- 使用300µl/孔清洗緩沖液A抽吸并清洗每個孔。重復該程序兩次，共
3次清洗
- 向各孔中加入100µl稀釋的NE-Tag。用封板覆膜覆蓋，并在37 ℃下孵育30 min
- 使用300µl/孔清洗緩沖液B抽吸并清洗每個孔。重復該步驟兩次，總計
3次清洗
- 向各孔中加入100µl稀釋標準品、樣品和空白。用封板覆膜覆蓋，并在37 ℃下孵育30 min
- 使用300µl/孔清洗緩沖液A抽吸并清洗每個孔。重復該程序兩次，共
3次清洗
- 向每個孔中加入100µl稀釋的結合物。用封板覆膜覆蓋，并在37 ℃下孵育60 min
- 使用300µl/孔清洗緩沖液A抽吸并清洗每個孔。重復該程序兩次，共
3次清洗
- 每孔加入100µl TMB底物溶液。用封板覆膜覆蓋，并在37 ℃下孵育10 min。避光保存
- 向各孔中加入50µl終止液。孔內顏色應從藍色變為黃色
- 在15 min內使用設置為450 nm的酶標儀測定每個孔的光密度。
結果計算
計算各標準品、對照品和樣品重復兩次讀數的平均值，并從終結果中減去零空白。通過生成log x-軸繪制標準曲線，并將曲線擬合為樣條曲線或4參數邏輯擬合。如果樣品已被稀釋，則應根據稀釋因子校正報告的濃度。
檢測試劑盒的局限性
正確存儲所有組件(_s)
_使用所有未開封的試劑在其有效期內
_請勿與其他批次或來源的試劑混合或替代
_所有程序均應按照方案進行
_如果樣品產生的結果高于高標準品，則應使用NE標準品稀釋劑進一步稀釋樣品并重復。
技術提示
_本試劑盒僅供有資質的人員使用
_按照國家和當地法規以安全方式處置容器和未使用的內容物
_為避免交叉污染，在添加各標準品、樣品和試劑之間更換移液器吸頭。此外，每種試劑使用單獨的儲液器
_為確保結果準確，在孵育步驟期間必須適當粘附封板覆膜
_囊性纖維化患者痰液或支氣管肺泡灌洗液(BALf)用NE標準稀釋液稀釋至少100倍。COPD樣本的建議起始稀釋度為10倍
