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上海旦鼎談關(guān)于溫度梯度PCR和降落PCR

時(shí)間:2019/4/25閱讀:2071
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 關(guān)于溫度梯度PCR和降落PCR的區(qū)別:

  溫度梯度PCR是指在退火溫度不太明確時(shí),為了找到優(yōu)退火溫度,在一臺(tái)PCR儀上同時(shí)做多管PCR,每一管放在儀器內(nèi)不同列(有的是不同行)上,分別進(jìn)行PCR(如50~60可以分6管,分別為505254565860度),后看看哪個(gè)溫度的效果好。總之是用來(lái)進(jìn)行退火溫度優(yōu)化的。

  降落PCR是在同一個(gè)PCR管內(nèi)進(jìn)行PCR,只是每個(gè)循環(huán)的溫度不同(如每個(gè)循環(huán)降1度)。一般兼并引物用這種方法多些。

 

降落PCRtouchdown PCR),一種PCR技術(shù):

 設(shè)計(jì)多循環(huán)反應(yīng)的程序,以使相連循環(huán)的退火溫度越來(lái)越低。由于開(kāi)始時(shí)的退火溫度選擇為高于估計(jì)的Tm值,隨著循環(huán)的進(jìn)行,退火溫度逐漸降到Tm值,并終低于這個(gè)水平,用于確保個(gè)引物—模板雜交事件發(fā)生在互補(bǔ)的反應(yīng)物之間,即那些產(chǎn)生目的擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)物之間。盡管退火溫度終會(huì)降到非特異雜交的Tm值,但此時(shí)目的擴(kuò)增產(chǎn)物已開(kāi)始幾何擴(kuò)增,在剩下的循環(huán)中處于*過(guò)任何滯后(非特異)PCR產(chǎn)物的地位。

 由于目標(biāo)是在較早的循環(huán)中避免低Tm值配對(duì),在TDPCR中好應(yīng)用熱啟動(dòng)技術(shù)。設(shè)計(jì)時(shí),退火溫度的范圍應(yīng)跨越15左右,從高于估計(jì)Tm值至少幾度到低于它10

 例:一對(duì)沒(méi)有簡(jiǎn)并的引物—模板的計(jì)算Tm值為62

 則:從65℃—>50(每2cycles降退火溫度1),再在50退火溫度下做15個(gè)循環(huán)。

 實(shí)驗(yàn)中如持續(xù)出現(xiàn)假象帶(雜帶),則是因?yàn)槠鹗纪嘶饻囟忍停蚰康臄U(kuò)增產(chǎn)物和非目的產(chǎn)物的Tm值相差無(wú)幾,或非目的擴(kuò)增物以更高的擴(kuò)增效率擴(kuò)增,可把退火溫度每降低1所需的循環(huán)數(shù)增加到34

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