飼料中的氨基酸 檢測方法包
杭州天釗科技有限公司
一. 儀器及試劑
儀 器：
1). 天平一臺（精度0.1mg）；
2). 恒溫水浴鍋一臺；
3). 容量瓶；
4). 試管（1.5×15cm或1.5×10cm）；
5). 微量進樣器（5ul或10µl）一支；
6). 微量可調移液槍（1000ul）一支、吸頭多個；
7). 旋渦混勻器一臺；
8). HPLC系統及氨基酸分析柱（4.6×250mm）；
9). LC500梯度系統一臺
試 劑：
1). 超純水（≥18MΩ?cm）；
2). 乙腈（HPLC級）；
3). 三水合醋酸鈉（分析純）；
4). 冰醋酸（分析純）；
5). 衍生試劑A和衍生試劑B溶液，至于冰箱保存（衍生試劑包對身體有害，用時請做好防護措施）；
6). 正己烷（HPLC級）。
二：樣品制備
準確稱取飼料10-50 mg，置于25 mL具塞比色管中，加1.0 mol/L鹽酸10 mL，攪拌提取15 min，靜置10分鐘，將上清液過濾到100 mL容量瓶中，殘渣加1.0 mol/L鹽酸10 mL，攪拌3 min，重復提取兩次，合并上清液，收集濾液并加1.0 mol/L鹽酸定容至刻度，搖勻。
三. 流動相的配制
流動相A： 0.1mol/L醋酸鈉溶液（pH 6.5）：乙睛＝93：7
配制方法：準確稱取三水合醋酸鈉13.6g于1000ml水中，攪拌均勻，使之溶解，用冰醋酸或氫氧化鈉溶液調pH值至6.5；準確量取配制好的三水合醋酸鈉溶液465ml和乙腈35ml，混合均勻，抽濾過0.45µm濾膜；
流動相B：水：乙腈＝20：80
配制方法：準確量取水100ml和乙腈400ml，混合均勻，抽濾過0.45µm濾膜；
四. 衍生化反應
1. 對照品溶液的制備
17種氨基酸對照品溶液用水稀釋至原來濃度的1/10倍稀釋作為對照品。
17種氨基酸對照品溶液稀釋10倍后，各氨基酸的濃度為：
Name | M.W. | C(mmol/L) | C(mg/ml) | Name | M.W. | C(mmol/L) | C(mg/ml) |
門冬氨酸 | 133.10 | 0.25 | 0.03328 | 胱氨酸 | 240.30 | 0.125 | 0.03004 |
谷氨酸 | 147.13 | 0.25 | 0.03678 | 纈氨酸 | 117.15 | 0.25 | 0.02929 |
絲氨酸 | 105.09 | 0.25 | 0.02627 | 蛋氨酸 | 149.21 | 0.25 | 0.03730 |
甘氨酸 | 75.067 | 0.25 | 0.01877 | 異亮氨酸 | 131.17 | 0.25 | 0.03279 |
組氨酸 | 155.15 | 0.25 | 0.03879 | 亮氨酸 | 131.17 | 0.25 | 0.03279 |
精氨酸 | 174.20 | 0.25 | 0.04355 | 酪氨酸 | 181.19 | 0.25 | 0.04530 |
蘇氨酸 | 119.12 | 0.25 | 0.02978 | 苯丙氨酸 | 165.19 | 0.25 | 0.04130 |
丙氨酸 | 89.093 | 0.25 | 0.02227 | 賴氨酸 | 146.19 | 0.25 | 0.03655 |
脯氨酸 | 115.13 | 0.25 | 0.02878 |
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2. 供試品溶液制備
精密量取/稱取供試品適量，并配制成相應濃度的溶液備用。
3. 衍生步驟
1）將恒溫水浴鍋預熱至50±1℃；
2）分別將A、B兩種衍生試劑用稀釋劑稀釋至原來濃度的1/5倍；
3）精密量取上述對照品溶液1ml，置于試管中，加入稀釋后的A溶液0.5ml和稀釋后的B溶液0.5ml，搖勻；在50±1℃水浴中加熱45分鐘，取出，加入正己烷溶液1ml，振搖；并用孔徑為0.45μm有機膜過濾，放置30分鐘后，取澄清的下層液進行分析試驗；
4）供試品的衍生步驟與對照品相同；
五. 色譜條件
1. 色譜柱：Ultimate® AA，5μm，4.6×250mm；
2. 梯度程序：
流動相A： 0.1mol/L醋酸鈉溶液（pH 6.5）：乙睛＝93：7
流動相B： 水：乙腈＝20：80
T(min) A% B%
0.01 100.0 0.0
11 93.0 7.0
13.9 88.0 12.0
14 85.0 15.0
29 66.0 34.0
32 30.0 70.0
35 0.0 100.0
42 0.0 100.0
45 100.0 0.0
60 100.0 0.0
流 速：1.0ml/min
柱 溫：40℃
波 長：254nm
進樣量：5μl
工作站記錄時間：60min
色譜圖：
六. 操作步驟和注意事項
1. 操作步驟：
1）設置柱溫40℃和流速1.0ml/min；
2）將A、B兩個通道用乙腈：水＝20：80排盡氣泡（如B通道的原存留液中不含緩沖鹽，則無需用乙腈：水＝20：80排氣泡），B通道用流動相B再排盡氣泡；
3）用乙腈：水＝20：80（A通道）沖洗系統20min，以防止緩沖鹽析出；
4）A通道用流動相A排盡氣泡，然后用流動相A走基線30min，平衡色譜柱；
5）運行一次空白梯度；
6）進樣分析；
7) 分析完成后：
I）用乙腈：水＝20：80代替流動相A，進水樣（清洗自動進樣器），進行梯度洗脫；
II）換90％乙腈沖洗色譜柱40min以上；
2. 注意事項：
1）進樣分析：先進對照品溶液，后進供試品溶液；
2）緩沖溶液，隔天需重新配制；
3）防止緩沖鹽析出。
氨基酸方法包，主要包括：
產品名稱 | 備注 |
LC500液相色譜儀梯度系統一套 天平一臺（精度0.1mg） |
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恒溫水浴鍋一臺 |
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容量瓶 |
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試管（1.5×15cm或1.5×10cm） |
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微量進樣器（100µl）一支 |
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微量可調移液槍（1000ul）一支、吸頭多個 |
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旋渦混勻器一臺 |
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HPLC 2000色譜工作站 |
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氨基酸分析柱（4.6×250mm） |
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超純水（≥18MΩ?cm） |
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Welpure 乙腈 4*4L（HPLC級） |
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三水合醋酸鈉（分析純） |
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冰醋酸（分析純） |
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Welpure正己烷 4*4L（HPLC級） |
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衍生試劑A，1瓶，10ml/瓶 |
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衍生試劑B，1瓶，10ml/瓶 |
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氨基酸衍生試劑稀釋劑，6瓶，10ml/瓶 |
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氨基酸標準溶液，2瓶，1ml/瓶 |
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