選擇一種恰當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒是影響基因表達(dá)的關(guān)鍵因素。請看ELISA試劑盒嘗試?yán)?0種不同的質(zhì)粒構(gòu)建成的融合質(zhì)粒表達(dá)相同的蟲熒光素酶報(bào)告基因，這10種融合質(zhì)粒表達(dá)出的蟲熒光素酶基因的表達(dá)水平各異。ELISA試劑盒告訴您影響基因表達(dá)的質(zhì)粒因素。蟲熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)水平依賴于空載質(zhì)粒的類型。以上是蟲熒光素酶報(bào)告基因在THP1和HUVEC細(xì)胞中在4小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)中的表達(dá)水平。在THP1細(xì)胞中，質(zhì)粒DNA的量為0.3-0.5μg。HUVEC細(xì)胞中質(zhì)粒DNA的量為2.5-4.4μg。
啟動子的類型是否適用于現(xiàn)在的細(xì)胞類型？ELISA試劑盒展示了在不同的細(xì)胞類型中啟動子的強(qiáng)度時(shí)不同的。盡管CMV在大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞中屬于較強(qiáng)的啟動子，但是另外的啟動子可能會在我們研究的這種細(xì)胞中有較強(qiáng)的表達(dá)(例如BHK-21細(xì)胞中SV40啟動子)。
內(nèi)含子
的基因表達(dá)需要基本的內(nèi)含子的剪切，然而這個(gè)觀點(diǎn)并不是總被大家認(rèn)可。內(nèi)含子的位置和強(qiáng)度會影響轉(zhuǎn)錄、mRNA的輸出和聚腺苷酸化。這樣，依賴于內(nèi)含子的位置，內(nèi)含子甚至?xí)?dǎo)致基因表達(dá)的降解。
IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))
內(nèi)核糖體剪切位點(diǎn)質(zhì)粒，啟動子驅(qū)動兩種基因的表達(dá)，一個(gè)是感興趣的克隆基因(經(jīng)常是處在上游基因)，另一個(gè)是報(bào)告基因，通常編碼GFP蛋白。IRES質(zhì)粒表達(dá)的mRNA是雙順反子信使，意味著兩個(gè)基因都在相同的mRNA分子上。兩種基因的雙順反子數(shù)量是一樣的，但是兩種基因的翻譯起始水平存在很大的不同。核糖體結(jié)合上游基因的起始位點(diǎn)是相當(dāng)有效的，然而IRES卻會讓核糖體與下游基因的結(jié)合和翻譯處于一個(gè)較低的水平。下游基因通常是GFP，因此GFP的表達(dá)水平就會低于沒有IRES序列的質(zhì)粒表達(dá)。而通常沒有IRES序列的GFP質(zhì)粒的表達(dá)水平我們認(rèn)為是正常的。可以通過構(gòu)建兩種基因的融合質(zhì)粒或者共轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)表達(dá)相同數(shù)量的感興趣的蛋白和GFP蛋白。
LTR(病毒長的末端重復(fù))
許多質(zhì)粒的表達(dá)利用逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR的啟動子和增強(qiáng)子，然而當(dāng)這些質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染進(jìn)入特定類型的細(xì)胞中時(shí)，可能會受到這些細(xì)胞對于其表達(dá)的抑制。盡管這種抑制機(jī)制未*闡明，很有可能是因?yàn)閬碜杂谀孓D(zhuǎn)錄病毒的啟動子或者增強(qiáng)子在某些原代細(xì)胞或者細(xì)胞系中不能很好的工作。*的解決辦法就是利用傳統(tǒng)的啟動子例如CMV(e.g.,pmaxCloning Vector),EF1a或者SV-40將基因重新克隆至新的載體上。
ELISA試劑盒質(zhì)粒的大小在實(shí)驗(yàn)室中我們通常會使用4-7kb的質(zhì)粒，而Lonza的Nucleofection可以轉(zhuǎn)染長至20kb的質(zhì)粒。若是更長的質(zhì)粒可能會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率的降低。通常的規(guī)則是，質(zhì)粒長度越長，越難進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。這個(gè)規(guī)則適用于電穿孔的方法以及脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法。