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漆酶活性檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號：BC1630

規格：50T/48S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 工作液的配制：一瓶試劑二用25 mL試劑一溶解。現用現配。

產品說明：

漆酶（CE1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶，屬于銅藍氧化酶家族，漆酶存在菇、菌及植物中，是一種環保型酶，其催化性質在生物檢測中有廣泛的應用。

漆酶分解底物ABTS產生ABTS自由基，在420nm處的吸光系數遠大于底物ABTS，測定ABTS自由基的增加速率，可計算得漆酶活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、低溫離心機、1mL玻璃比色皿、可調式移液槍、天平、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水，水浴鍋

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）   

1、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、細胞：按照細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測。

3、培養液：直接檢測。

二、測定步驟

1、 分光光度計預熱30min以上，調節波長至420nm，蒸餾水調零。

2、 水浴鍋溫度調至45℃。

3、 操作表：在1mL玻璃比色皿中分別加入下列試劑：

三、漆酶活計算

1、按蛋白濃度計算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×Cpr）÷T=61.7×ΔA÷Cpr

2、按樣本質量計算

酶活定義：每克樣本每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶酶活（U/g 質量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×W÷V樣總）÷T=61.7×ΔA÷W

3、按細胞數量計算

酶活定義：每10⁴個細胞每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×500÷V樣總）÷T=0.123×ΔA

4、按液體體積計算

酶活定義：每mL液體每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷V樣÷T=61.7×ΔA

ε：ABTS摩爾消光系數：36000L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應總體積，0.001L；V樣：反應中樣本體積，0.15mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測定；W，樣本質量，g；T：反應時間，3min；500：細胞總數，500萬；10⁹：單位換算系數，1mol=10⁹nmol。

注意事項：

1、工作液需臨用前配制，并且盡快使用，4℃保存一周，若變色則不能使用。

2、測定之前進行預實驗，若吸光值較高，請將樣本用提取液進行適當的稀釋再測定，并在計算公式中乘以稀釋倍數。

3、空白管為檢測各試劑組分質量的檢測孔，正常情況下，OD值變化不超過0.05。

實驗實例：

1. 取0.1g香菇加1mL提取液進行樣本處理，取上清后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定管=A2測定-A1測定=0.657-0.084=0.573，ΔA空白管=A2空白-A1空白=0.087-0.058=0.029，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.573-0.029=0.544，按樣本質量計算酶活得：

漆酶酶活（U/g 質量）=61.7×ΔA÷W=61.7×0.544÷0.1=335.648 U/g 質量。

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