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MTT配制以及注意事項

閱讀:3317      發布時間:2016-5-6
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MTT全稱為3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,又稱噻唑藍。用于細胞增殖及細胞活性測定和對體外細胞的細胞毒性的測定。
MTT的原理
檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臢(Zā)(Formazan)并沉積在細胞中,而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲臢(Zā),用酶標儀在490nm波長處(英文說明書寫的是570nm)測定其光吸收值,在一定細胞數范圍內,MTT結晶形成的量與細胞數成正比。根據測得的吸光度值(OD值),來判斷活細胞數量,OD值越大,細胞活性越強(如果是測藥物毒性,則表示藥物毒性越小)。
MTT配制方法
通常MTT配成的終濃度為5mg/ml,須用PBS(磷酸緩沖液)或生理鹽水做溶劑。(市面上一般MTT的包裝為100mg,250mg或1g)
1.對于100mg這樣的小包裝,廠家都是將MTT放入小管中的,建議不要再用天平稱量分裝,而應該一次性將其全配制成溶液,如100mg用20m1PBS來溶解。
具體做法:
預先在50ml離心管(沒有的話,可用培養瓶替代)加入20m1PBS,從中先吸取500-1000u1PBS
裝入含MTT的小管中,吹打若十次后將其移入50ml離心管,然后再混勻。可以重復幾次以使小管中的MTT不殘留于管內。將MTT*混勻后,用0.22?um濾膜過濾以除去溶液里的細菌,分裝避光(避光袋或是黑紙、錫箔紙包住)可長期保存于-20度。按細胞培養板每孔需加10u1計算,一般每96孔板約擊1m1,所以分裝時可考慮每管分裝1ml。
2.對于大包裝,可按上述方法稱取一部分溶解,也有人將粉劑分裝在EP管里,用的時候現配,直接往培養板中加。
3.配制MTT時用PBS溶解,也有人用生理鹽水配,60度水浴助溶。PBS配方:NaCl?8g,
KCl0.2g,Na2HPO41.44g,KH2PO40.24g,調PH?7.4,定容1L。
注意事項:
1、在配制和保存的過程中,容器好用鋁箔紙包住。
2、配成的MTT需要無菌,MTT對菌很敏感。
3、MTT一般好現用現配,過濾后4度避光保存兩周內有效,或配制成Smg/ml保存在-20
度長期保存,避免反復凍融,好小劑量分裝,用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。當MTT變為灰綠色時就不能再用。
4、MTT有致癌性,用的時候小心,有條件好帶那種透明的簿膜手套。

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