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噬菌粒文庫的保險性儲存
閱讀：1020 發布時間：2010-8-6制備好DNA文庫后，用標準方法將DNA電轉人大腸桿菌中，得到轉化株并保存，然后制備噬菌體用于分析和篩選。在液體培養基中將轉化后的細胞進一步培養到對數生長期。經過在液體培養基中的增殖，一些菌液用于甘油保種，剩下的用于制備噬菌體。或者可以通過將整個轉化體系鋪在含有選擇性抗生素的瓊脂平板上，而直接從固體培養基上得到轉化株。相信這個方法可以在保險性儲存的過程中，阻止一些特殊克隆的優勢生長。
電轉化和噬菌粒文庫的儲存，甘油保種的制備以及篩選所需的噬菌體的制備
[器材和試劑]
● 2TY/Carb/Tet瓊脂平板 （31g/L2TY，15g/L瓊脂，100/lg/m1羧芐青霉素和10ug/ml四環素）：取31g 2TY、15g瓊脂，加水至1L，然后高壓滅菌。待溶液冷卻至40℃，然后加入lml羧芐青霉素（100mg/m1）和1ml四環素（10mg/m1），充分混勻后鋪于皮氏培養皿中。
● 大腸桿菌電感受態細胞；如XLl—Blue的電感受態細胞（Stratagene）
● 將DNA電轉進大腸桿菌的試劑和設備
● 2TY和2TY/G1u培養基（含有或不含2％葡萄糖的31 g/L的2TY培養基）：將31g 2TY加入1 L水中，攪拌溶液讓2TY溶解后滅菌，待溶液冷卻，取100m1分裝入一個無菌的錐形瓶中，并加入10m1 20％（w/v）的葡萄糖（過濾滅菌）。
● 10mg/m1的四環素：溶于超純水后過濾滅菌
● 100mg/m1的羧芐青霉素：溶于超純水后過濾滅菌
● 100mg/m1的卡那霉素：溶于超純水后過濾滅菌
● 無菌的-50％的甘油水溶液
● 卡那霉素抗性的VCS—M13輔助噬菌體儲液（1010pfu/m1）（Stratagene）
● PEG-NaCl溶液：20％PEG，2．5mol/l NaCl
● 磷酸鹽緩沖液（PBS） （2 mm01/L NaH2P04，16mmol/L Na2HP04，150mm01/L NaCl，pH 7．4～7．6）：將8g NaCl、0．2g KCl、1．44g Na2HPO4和0．24g NaH2PO4溶于800m1去離子水中，用鹽酸調節pH至7．4，然后加水至1L。
● DNA文庫
● Oakridge 型 40m1 離，乙，管 （Nalge Nuno）
● Sorvall RC 5Cplus型離心機及SS—34型轉子，或其替代物
[方法]
1，取10/Il得自實驗方案8．2中步驟6的混合物， 電轉入大腸桿菌的dut+ung+型菌株 （如XLl—B1ue） 中。大文庫容量的文庫可能需要多次電轉化。在我們對泛素系統的研究工作中，我們將文庫電轉入購自Strat agene的XLl—Blue電感受態細胞。可以替換的菌株包括SS320或TGl。
2．將電轉后細胞的適當稀釋液鋪于2TY/Carb/Tet0瓊脂平板中， 以測定轉化株的數量。隨后可以使用平板上的菌落，通過PCR、限制性酶酶切及測序，來檢驗文庫。
3．在250ml的錐形瓶內，將電轉后的菌液（得自步驟1）加入到40m1含有12ul 100mg/ml的羧芐青霉素和20/A1 10mg/ml的四環素的2TY/Glu培養基中。
4．將菌液在37℃振蕩培養至對數生長期，直到OD600＝0．5，這通常需要4—5個小時。l小時后將12ul 100mg/ml的羧芐青霉素20ul 10mg/ml的四環素①加入到錐形瓶中。
5．取出4m1菌液，加入1．5ml 50％的甘油，每管1m1分裝后于-80℃儲存。
6．將4ml VCSMl3輔助噬菌體（約1010pfu/ml）加入到剩余的菌液中，以使噬菌體與大腸桿菌之比達到10倍左右。將錐形瓶子37℃靜置15～30分鐘。
7．將l/4的菌液（約10ml），分別加入到4個含有100ml 2TY/Glu培養基、75ul 1100mg/ml的羧芐青霉素和100ul 10mg/ml的四環素的250m1錐形瓶中。將錐形瓶于37℃振蕩培養，直到菌液開始輕微變渾（約2小時）。
8．加入70ul 100mg/ml的卡那霉素，并于37℃振蕩培養過夜。
9．第二天上午，將每份過夜培養的菌液各自分裝入3只Oakridge離心管中，在Sorvall RC 5C plis型離心機中使用SS—34轉子， 于4℃12000 r/min離心15分鐘。
10．從每只離心管中取出30ml上清液，并與7．5ml PEG—NaCl溶液混合，以沉淀噬菌體顆粒。將這些離心管于冰上放置1小時，偶爾混勻液體。
11．如步驟9中所述，于12000r/min離心15分鐘，吸出并棄去上清液。
12．將噬菌體沉淀重懸于PBS中，每管1ml。將重懸后的噬菌體轉移至新的小離心管中，開用小型離心機于10000r/min離心，除去不溶性的殘渣。將干凈的上清液轉移至新的小離心管中并于4℃保存。