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用免疫親和反應(yīng)選擇gⅥ—cDKA噬菌體文庫
閱讀：813 發(fā)布時(shí)間：2010-7-26[器材和試劑]
●PBST
●牛血清蛋白（BSA）（Sigma）
●抗血清及gⅥ—cDNA噬菌體文庫
●無菌15ml聚丙烯管（Falcon）
●立式旋轉(zhuǎn)機(jī)
●蛋白A—瓊脂糖凝膠珠（Amersham Biosciences）
●無菌0．1mol/L鹽酸甘氨酸，pH 2．2加0．1%（w/v）BSA
●無菌2mol/LTris堿（未調(diào)節(jié)pH）
●于板*0F，
●37℃培養(yǎng)箱
●LB
●LBAT平板
●無菌直徑為16mm或18mm的培養(yǎng)管
●37℃振蕩培養(yǎng)箱
[方法]
1.用10m1含1%（w/v）BSA的PBST稀釋2．5ul抗血清，并倒入15ml聚丙烯管中，再加入1011～1012TU的gⅥ—cDNA噬菌體文庫。
2．室溫下緩慢旋轉(zhuǎn)孵育該混合物1小時(shí)。
3．往混合物中加500ul 1/1（體積比）蛋白A—瓊脂糖凝膠珠漿[在PBST用5%（w/v）BSA預(yù)處理]，在室溫下再孵育l小時(shí)。
4．離心（500g 5分鐘）收集蛋白A—瓊脂糖凝膠珠并且用10ml PBST沖洗蛋白A—瓊脂糖凝膠珠10次。
5．在1ml PBST溶液中打散蛋白A—瓊脂糖凝膠珠，將混合物轉(zhuǎn)移到微離心管中并旋轉(zhuǎn)（10000g 10秒），除去上清液。
6．0．5m1 0．1mol/L鹽酸甘氨酸，pH 2．2，并加入0．1%（w/v）BSA溶液中打散蛋白A—瓊脂糖凝膠珠。
7．室溫下孵育樣品10分鐘。
8．快速離心樣品（10000g 10秒）并將上清液轉(zhuǎn)移到一新的微離心管中。
9．加30ul 2mol/LTrls中和該溶液，在冰浴中保存溶液。
10．噬菌體擴(kuò)增，將抽提出來的一半噬菌體（256ul）加到平板Topl0F’細(xì)胞中。37℃溫育30分鐘。