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熒光色素與可用于標記抗體的熒光素
閱讀：1495 發布時間：2011-1-8能夠產生熒光并能作為染料的化合物稱為熒光色素，熒光色素必須具備吸收激發光的光能并發射熒光，具有吸收一定頻率光能的生色團和能產生一定光量子的熒光團。吸收的光能轉變為熒光的比例（％）稱為“熒光效率”。熒光效率與發射熒光量子的數值成正比。
熒光強度（即發射熒光的光量子數）與激發光（吸收的光量子數）的強度有關，激發光越強，熒光也越強。熒光素可以發射紅、橙紅、黃、綠及藍色等熒光。光的強弱也與熒光素溶液的pH值、濃度以及染色時間和溫度等條件有關。
熒光素的種類很多，但用于標記抗體的熒光素不同于一般熒光色素，它必須具備以下條件。
①應具有與蛋白質分子形成共價鍵的化學基團，結合后不易離解其降解，而未結合的色素及產物容易排除。
②熒光效率高，與蛋白質結合后熒光效率下降不多。
③結合抗體蛋白后對抗體的免疫學性質和生化性質無影響，用于活體內標記結合物應無毒性，附加抗原性小。
④與蛋白質結合的方法簡便而快速，結合物在一般條件下穩定。
⑤熒光素容易溶解，溶解后不會和其他物質發生化學反應。
⑥熒光顏色與背景組織的自發熒光顏色對比鮮明，能清晰判斷結果。
用于標記抗體和蛋白質的熒光色素到目前為止有幾十種，下面舉幾種傳統的、較為常用的熒光素。
1．異硫氰酸熒光黃
異硫氰酸熒光黃（fluoreseicnisothiocyanate，FITC）純品為黃色粉末，有兩種異構體，易溶于水和乙醇等溶劑，在溶解狀態下呈黃綠色熒光。性質穩定，低溫干燥下可保存多年，室溫下也可保存2年以上。FITC分子質量為390Da，zui大吸收光譜為490～495nm，zui大發射光譜為520—530nm，呈現明亮的黃綠色熒光，其中異構體I型熒光效率更高，與蛋白質結合更穩定。
在堿性條件下，FITC的異硫氰酸基在水溶液中與免疫球蛋白的自由氨基經碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵，結合成為標記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。一個IgG分子上zui多能標記15～20個FITC分子。
2．四甲基異硫氰酸羅丹明
四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）是一種紫紅色粉末，較穩定，是羅丹明（Rhodamine）的衍生物，易溶于水。zui大吸收光譜為550nm，zui大發射光譜為620nm，呈橙紅色熒光，與FITC發射的黃綠色熒光對比鮮明，經常用于雙標記染色，使用較多。
3．四乙基羅丹明
四乙基羅丹明（tetraethyl rhodamine B200，RB200）是褐紅色粉末狀，溶于乙醇和丙酮，不溶于水，zui大吸收光譜570nm，zui大發射光譜596～600nm，呈橙紅色熒光。因為RB200比較價廉，廣泛用于免疫熒光組化染色和雙標記示蹤或染色，RB200不能直接和蛋白質結合，要先經五氯化磷（PCIs）作用下轉變成磺酰氯（SOzCl），在堿性條件下易與賴氨酸‘氨基反應而結合在蛋白分子上。其分子質量為580Da。