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亞適劑量抗IsM抗體刺激B細(xì)胞增殖法檢測IL-4
閱讀：653 發(fā)布時間：2012-6-9亞適劑量抗IgM抗體對B淋巴細(xì)胞的刺激較弱，當(dāng)加人IL-4時，B淋巴細(xì)胞對亞適劑量抗IgM抗體刺激表現(xiàn)出明顯的DNA合成增加，3H-TdR摻人量與IL-4含量相關(guān)。
（1）小鼠脾臟B細(xì)胞懸液的制備
1）取BALB／c或C57BL／6小鼠，常規(guī)方法分離脾臟淋巴細(xì)胞。用Hanks液洗2次；再用10％NBS-IMDM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1X107～2X107／mL。
2）去除粘附細(xì)胞：將上述脾細(xì)胞懸液置24孔培養(yǎng)板，每孔1～1．5mL，置37cC，5％C02溫箱中培養(yǎng)1h；將細(xì)胞懸液移至另外培養(yǎng)孔內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)1h，收集非粘附脾細(xì)胞；亦可通過SephadexG-10柱去除粘附細(xì)胞。
3）去除T細(xì)胞：調(diào)整細(xì)胞濃度至5X107／mL，按1：40（V／V）加入抗小鼠T細(xì)胞血清或抗Thy-1，2McAb，置4~C 30min后，按1：15（V／V）加入新鮮豚鼠混合血清，充分混勻后溫育1h；離心棄上清，用無血清培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞。此時T細(xì)胞已死亡破碎，通過淋巴細(xì)胞分層液，低速離心予以去除。
4）B細(xì)胞的相對純化：用淋巴細(xì)胞分層液500—800r／min離心6—8min，將上述細(xì)胞懸液再次純化；用Hanks液洗1—2次，調(diào)整細(xì)胞濃度至1X106—2X106／mL。
（2）誘生上清IL-4含量的測定
1）將上述B細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板，100~tL／孔，分別加入待測IL-4誘生上清或不同量標(biāo)準(zhǔn)品rlL-4，其濃度為每毫升0．5U、1U、2U、3U、4U、5U、6U，各組均設(shè)3復(fù)孔。
2）加亞適劑量抗IgM抗體，一般終濃度0．5％（V／V）為抗IgM的亞適劑量，也可在實(shí)驗前自行測定。
3）常規(guī)培養(yǎng)48～72h，結(jié)束前8-16h加入3H-TdR，收獲細(xì)胞測定cpm值；以標(biāo)準(zhǔn)品cpm值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出IL-4活性。
（3）注意事項
1）B細(xì)胞純度直接影響結(jié)果，B細(xì)胞懸液中若含有T細(xì)胞或死亡T細(xì)胞及其碎片，可影響試驗結(jié)果。因此有人主張用Percoll不連續(xù)密度梯度離心，去除死細(xì)胞及碎片，可得到較高純度的B細(xì)胞懸液。
2）純化B細(xì)胞懸液時，應(yīng)盡量縮短操作時間，減少不利因素，保證細(xì)胞活力，使實(shí)驗結(jié)果較穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。
3）誘生細(xì)胞上清收獲時間必須控制在30h左右。時間過長，上清中IL-4含量會降低。