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白介素5（IL-5）的檢測
閱讀：1810 發(fā)布時間：2012-5-191．依賴細(xì)胞株增殖法 IL-5依賴株有CHl2、B13、T88-M和BCLl細(xì)胞，其培養(yǎng)條件和操作步驟與用CTLL-2細(xì)胞3H-TdR摻人法檢測IL-2類似，推薦細(xì)胞濃度和加3H-TdR前后的培養(yǎng)時間見表。
各種IL-5依賴細(xì)胞株檢測ID5的參考實驗條件
細(xì)胞株 細(xì)胞濃度 加3H-TdR前培養(yǎng)時間 加3H．TdR后培養(yǎng)時間
CHl2 5×l103／mL 48h 6h
B13 5×104／mL 36h 12h
T88-M 5×105／mL 24h 12h
BCL1 5×105／mL 72h 6h
2．DXS共刺激B細(xì)胞增殖法
（1）常規(guī)制作B細(xì)胞懸液（同IL-4檢測），使其濃度為1X106／mL，并加入10ug／mL硫酸葡聚糖（dextransulfate，DXS）。
（2）取細(xì)胞懸液100uL加入已含有IL-5待測上清的96孔板中，37℃，5％C02溫箱中培養(yǎng)60—72h。
（3）每孔加入0。5tu／20uL 3H-TdR，繼續(xù)培養(yǎng)6—8h，收集細(xì)胞后，p—液閃儀測定cpm值。IL-5含量的確定，同依賴株檢測IL-3。
3．LPS共刺激B細(xì)胞分泌IgA
（1）同上制備B細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1X106／mL，并加入20Vz／mLLPS。
（2）取上述細(xì)胞懸液100ktL加入已含有IL-5待測上清的96孔板中，37℃，5％C02溫箱內(nèi)培養(yǎng)4—5d后，取無細(xì)胞上清100uL，用ELISA法檢測其中IgA含量。
4．嗜酸性粒細(xì)胞集落刺激法 操作步驟基本同前述“集落形成法”測IL-3活性。
5．過氧化氫酶檢測法 IL-5刺激嗜酸性粒細(xì)胞增殖時，嗜酸性粒細(xì)胞合成并釋放過氧化氫酶也隨之增加。因此，測定培養(yǎng)上清中過氧化氫酶的含量可反映IL-5的活性。
（1）常規(guī)制作骨髓細(xì)胞，用10％NBS-IMDM調(diào)整細(xì)胞濃度至5X106／mL。
（2）取細(xì)胞懸液100uL加入含有IL-5待測上清的96孔板中，37℃，5％C02溫箱中培養(yǎng)48h。
（3）取100uL上清，加入100ul過氧化物酶試劑，室溫作用30min，加入50uL 4m01／LH2S04終止液，于492nm測OD值。
[附]過氧化物酶試劑貯存液：①0．05mol／LTris-HCl緩沖液pH8．0；②10％三硝基甲苯X-100（4℃貯存）；③20mg／mL0-鄰苯二胺（OPD）（避光）；④30％U202（4℃）。
過氧化物酶試劑應(yīng)用液（臨用前配制）：①50mL 0．05mol／LTris-HCl緩沖液；②0．5mL10％三硝基甲苯X-100；③0．5mL20mg／mLOPD；④6uL 30％U202。