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技術文章

抗凝血因子Ⅷ抗體自身抗原

閱讀:525          發(fā)布時間:2011-8-22

雖然經研究發(fā)現(xiàn),抗凝血因子Ⅷ(FⅧ)抗體的陽性率極底,但是這種自身抗體卻不容忽視,它常是抑制機體凝血系統(tǒng)的zui主要因素。
血栓形成與止血委員會曾對在過去的十年中經118名內科醫(yī)師確診的215名帶有FⅧ:C抑制因子的非血友病患者進行一項深入地調查。發(fā)現(xiàn)有46%的人沒有明顯的臨床癥狀,但隨著年齡的增長,其自身抗體增多的危險性也隨之增大,17%的帶有自身抗體的患者年齡在50~60歲之間,48%的患者年齡超過60歲。
大約有l(wèi)/3的人體內的抗FⅧ自身抗體能自行消失,但大多數(shù)情況下,它可以在體內潛伏數(shù)年直至引發(fā)嚴重的危及生命的出血。雖然,已有幾種療法可以稍減少這種自身抗體的產生,但是,總體而言療效不夠理想。

1.定義 FⅧ是參與凝血旁路途徑中一種至關重要的糖蛋白。在沒有磷脂和鈣離子的參與下,它和凝血因子Xa(FXa)可以共同作用于·FX的酵解過程。缺乏FⅧ或其完整分子將會導致諸如血友病A(一種僅發(fā)生于男性中的X一聯(lián)疾病,且概率為l/10 000)等出血性疾病的產生。

2.特性 FⅧ有兩種形式,天然型和基因重組型,而且普通的凝血分析和染色分析很難區(qū)分出這兩種類型分子。由于基因重組型分子是全長的,而天然型分子為其片段,研究者推測它們會結合不同的自身抗體,所以免疫分析法有望能區(qū)分這兩種類型分子。
天然型FⅧ分子是一含2 332氨基酸的單一的多肽鏈,其全部氨基酸序列已測定。通過克隆FⅧ并表達于哺育動物細胞中研究發(fā)現(xiàn),其分子中有一包含2351個氨基酸單鏈前體的開放閱讀框,而且此結構中又有19個氨基酸單肽可以異位到胞質內質網上,并進行糖基化加工。一個FⅧ分子糖基化zui大程度可達到330kd/MW。
FⅧ分子有A、B、C三個區(qū)。其中A區(qū)有兩個部分:A1(1~329氨基酸)和A2(380~711氨基酸),它們被一在功能上*的酸性區(qū)域所分隔。A1、A2組成了FⅧ的重鏈(92kD/MW)。而輕鏈主要由A3(1649-2091氨基酸)、C1和C2組成(80kD/MW)。重鏈和輕鏈的連接區(qū)為B區(qū)(含948氨基酸,且包含80%的糖基化位點),從而因B區(qū)的構成不同,產生兩種不同類型的內源性分子。一種構型是A片段的3倍,包含30%的序列相似性。另一種構型是C片段的兩倍,含有羧基末端。因此,整個FⅧ分子結構是一線性構型,即A1-A2-B-A3-C1-C2。由于B區(qū)對于FⅧ分子功能是可有可無的,所以一些截短的FⅧ分子在結構上*去除B區(qū)或用一合成肽部分取代B區(qū)。
循環(huán)型FⅧ是異二聚體形式,它可以通過蛋白酶水解其前體而獲得。FⅧ的三個主要酶解位點對其活性而言是至關重要的:位于A1和A2區(qū)之間的酸性區(qū)域;位于A2區(qū)的羧基末端;位于B區(qū)和A3區(qū)連接點的輕鏈酸性區(qū)的羧基末端。因此,循環(huán)中存在的FⅧ的活性形式一異三聚體。其可以進一步被凝血酶、FXa、活性蛋白C水解而滅活。這些FⅧ分子的不同活性形式能夠影響其與特異性抗體的結合。

3.來源 天然型FⅧ分子由肝臟產生。基因重組型FⅧ則是通過用全長或部分的DNA表達載體轉染中國倉鼠細胞(CHO)或幼鼠腎臟細胞而產生。

4.純化 先對獻血者的血漿進行冷沉淀得到FⅧ樣品,再經過過濾、離子交換或親和層析、免疫親和層析、染色分析等一系列方法除去雜質蛋白。其中免疫親和層析法是將含F(xiàn)Ⅷ的冷沉淀物經過一預先交聯(lián)抗FⅧ的鼠單克隆抗體或VWF的交換柱,將其結合物洗脫后,再經過一離子交換柱以除去鼠免疫球蛋白雜質

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