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上海源葉生物科技有限公司>技術文章>ENA多肽抗體譜檢測

技術文章

ENA多肽抗體譜檢測

閱讀:1666          發布時間:2011-3-24

   核抗原有三個組成部分:組蛋白、DNA、可溶性核抗原,后者因可溶于磷酸鹽緩沖液(或生理鹽水)中,故名可提取核抗原(extractable nuclear antigen,ENA)。從分子水平識別ENA多肽抗體是20世紀80年代抗核抗體研究的重大進展,現已發現這類抗體有十余種,抗ENA抗體為其總稱。

 
    檢測ENA抗體過去多用瓊脂雙向擴散、對流免疫電泳,近年來也建立ELISA法?,F已從免疫擴散法發展到與分子生物學有關的免疫印跡技術(1BT),且國內已有抗ENA多肽抗體譜檢測試劑盒出售。IBT與對流電泳和雙擴法相比,更敏感特異,且操作簡單快速,不需特殊設備,整個檢測時間一個半小時即可完成,能在各級醫院應用,從而將風濕性疾病的診斷和鑒別診斷提高到分子水平。
 
    1,ENA多肽抗體譜檢測原理  通過對抗原抽提及酶聯免疫檢測技術的改進,將抗原中的蛋白質分子按分子量大小分離后轉移至硝酸纖維素膜上,通過與抗體反應,觀察與特異性抗體反應的多肽的分子量和數量,不僅可以用來檢測自身抗體,還可用于抗原分子的組成及抗原表位的研究。試劑盒中已將具有7種不同抗原性的ENA,如Sm、ulRNP、SSA、SSB、Jo-1、Scl-70和Rib等印跡在硝酸纖維素膜上,可通過IBT一次檢測這7種自身抗體。
 
    2.試劑  試劑盒內有濃縮洗滌液、酶標抗體、顯色劑A、顯色劑B、終止液、印跡薄膜。
 
    3.操作步驟
    (1)將濃縮洗滌液用蒸餾水按說明書進行稀釋,然后每槽各加lmL,同時每槽加待測血清lOpL,充分混勻,置37℃孵育30rain。
    (2)取出反應槽,棄去槽中液體,用吸水紙吸干,加入已預溫37%的洗滌液,搖動洗滌4次,每次每槽加lmL,洗1min。
    (3)每槽加入洗滌液0.5mL,再加所提供的酶標抗體10uL,混勻后置37%孵育30rain。
    (4)同上洗滌后,加入顯色劑A0.5mL+顯色劑B0.5mL,作用5~10min。
    (5)待陽性帶顯色清晰,即加終止液0.5mL,2min后棄去液體,用自來水洗滌后取出薄膜,待干后即可判斷結果。
 
    4.結果判斷  將薄膜上顯色帶與陽性標準帶對照即可判斷出陽性自身抗體。如:①顯色區帶是29kD、28kD、13.5kD為抗Sm抗體;②顯色區帶是73kD、32kD、17.5kD為
抗ulRNP抗體;③顯色區帶是52kD為抗SSA抗體;④顯色區帶是48kD、47kD、45kD為抗SSB抗體;⑤顯色區帶是86kD、70kD為抗Scl-70抗體;⑥顯色區帶是55kD為抗Jo-1抗體;⑦顯色區帶是38kD、16.5kD、15kD為抗Rib抗體。
 
    5.注意事項  ①判斷結果時,應將薄膜記號線與標準帶“0”線對齊;②不同批號的標
準帶不可混用。
 
    6。臨床意義  抗Sm是SLE的標志抗體且與狼瘡性腎炎活動程度相關??箄lRNP是MCTD的標志抗體,少見于SLE、PSS等;抗SS-A和抗SS-B是SS的標志抗體,少見于SLE、MCTD、PSS等;抗Scl-70是PSS的標志抗體;抗Jo—1是PM/DM的標志抗體;抗Rib是SLE的標志抗體,少見于PSS等。

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